抗体亲和力的体外定向进化及一种连续定向进化系统的搭建

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1、UniversityofScienceandTechnologyofChina博士学位论文论文题目抗体桌和力的体外走向选化及一种連续走向迷化糸晚的格建明冬梅作者姓名生物化学与务子生物学学科专业到海燕教梭洪洞到教梭导师姓名—五年五月完成时间博士学位论文抗体亲和力的体外定向进化及一种连续定向进化系统的搭建作者姓名：胡冬梅学科专业：生物化学与分子生物学导师姓名：刘海燕教授洪洄副教授完成时间：二〇一五年五月UniversityofScienceandTechnologyofChinaAdissertationf

2、ordoctor'sdegreeInvivodirectedevolutionofantibodyaffinityandtheimplementationofacontinuousdirectedevolutionsystemAuthor'sName：：：中国科学技术大学学位论文原创性声明本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研宄工作所取得的成果。除己特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写过的研宄成果。与我一同工作的同志对本研宄所做的贡献均己在论文中作了明确的说明。中国

3、科学技术大学学位论文授权使用声明作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入《中国学位论文全文数据库》等有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后也遵守此规定。公开口保密（年）签字日期：签字曰期：屬摘要摘要蛋白质生物分子进行进化以来己经历经数十年，一般

4、目标分子的进化必需经历如下过程：目标分子基因水平序列随机化（建库），利用感受态转化方法将库导入宿主菌（建有生物活性库），根据与靶标分子相互作用结合能力强弱不同筛选出阳性突变体（筛选），将筛选获得分子再次转入宿主菌，进行下一轮筛选，循环往复，直至最终获得期望性能的一个甚至数个突变体，完成目标分子定向进化。本课题选择传统噬菌体展示技术这种体外进化方法对人源化抗抗体进行亲和力改造。几十年来，噬菌体展示技术被广泛用于抗体亲和力成熟。随着技术的发展，其更有效更广泛的应用却受限于两点：抗体库序列有限的多样性和对筛选

5、后高亲和力抗体突变体冗余复杂且耗时的鉴定。本课题我们将介绍一种新型的抗体库构建和筛选方法用以解决该问题。首先，利用微扰突变（的方法对该人源化抗抗体，的多个区分别进行定点多样化：用，，三类简并密码子引入氨基酸饱和突变能够同时避免引入半胱氨酸和终止密码子。在两块芯片上共合成并洗脱了条简并寡核苷酸用以构建五个单链抗体库，其总库容为序列多样性。通过平台对未筛选及筛选后的噬菌体库进行高通量测序使我们能够深度了解序列及氨基酸组成的丰度。高通量测序技术用于鉴定筛选后有效的高亲和力抗体，这样能够跨过初级的靶标特异性鉴定

6、过程。为了判断髙通量测序鉴定方法的可信度，我们随后综合结果中四个库的前十个丰度最高的序列构建了一个组合库并进行筛选，最终获得了亲和力提高倍（尤的一个抗体突变体。这些结果预示我们的方法在优化抗体和其他生物分子结合能力方面的潜在应用。该传统体外展示用以进化的方法其不足之处在于受限于构建的突变库的库容、筛选的有效性，并且每一轮筛选都需要连续的人力输入，低效而且耗时。近几年，实验室创建的系统（在快速简化生物大分子定向进化上功效颇高，能帮助研究者解决如上传统进化方法必然出现的问题。该定向进化系统包括一个体积固定的

7、培养瓶，新鲜的宿主菌源源不断的流入，被大瓶中预置的包含靶标基因的噬菌体侵染后该噬菌体宿主菌混合物再源源不断流出。该系统将噬菌体侵染能力与靶标基因的特定功能偶联，使得特定噬菌体的富集依赖于靶标基因的功能提高。所以，噬菌体复制侵染一代就等于传统方法中的一轮突变筛选而且不需要人力投入。但是近几年系统自被报道以来，其发展仅局限于一处实验室，广泛使用有待发展。因此，本课题中，我们在本实验室尝试用系统定向进摘要化基因因子使其编码蛋白最终能够和无关序列有较强且特异性的相互作用。我们计划构建该系统后将其用于人工合成无功

8、能蛋白的功能赋予。目前我们还在进一步的摸索实验来搭建该系统。关键词：抗体库亲和力成熟噬菌体展示因子连续定向进化AbstractABSTRACTOverthepastdecades,laboratory-directedevolutionhasemergedasapowerfultechnologyplatforminproteinengineering.Currently,directedevolutionofatargetmolecule