d海因酶的体外分子定向进化和定点突变

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1、摘要光学活性D一氨基酸常作为一种中间体被广泛应用于半合成抗生素、多肽激素、拟除虫菊脂、杀虫剂等的合成。目前，工业范围的D一氨基酸生产大都采用酶法转化，首先是在D一海因酶的作用下，催化5’一单替代海因形成氨甲酰类氨基酸，后者再在酶或酸催化下，生成相应的光学活性氨基酸或其衍生物，因此，D一海因酶是生物转化D一氨基酸的关键催化剂。众所周知，酶是一种生物大分子，易受诸如pH、温度、氧化剂等因素的影响而导致酶活性降低或丧失；因此，我们利用体外定向进化技术对本室保存的D一海因酶基因进行了改造，试图获得性能更为优良的产酶菌株。利用易错PCR技术使D一海因酶基因引入随机突变，经反复优化，将PCR条件确立为

2、0．15mmol／LMn”+3mmol／LMg”；0．3mmol／LMn”+3mmol／LMg”；0．5mmol／LMn2++2．5mmol／LM92+三个离子浓度梯度。将PCR扩增产物克隆到pET-3a载体，转化叵coilBL21(DE3)，利用96孔板初筛阳性克隆，经两轮筛选了近i，000个菌落，最终获得较高活性的产酶菌株：叵coliBL21／pE—HDT；，(A)和EcoliBL2i／pE—HDT。5(B)。以对羟基苯海因为底物，前者酶活性为初始菌株∽coliBL2i／pE—HD?)的2．7倍，为野生菌株(PseudomonasputidaYZ一26)的20倍，若以海因为底物，则分别

3、为1．4倍和15倍。后者以对羟基苯海因为底物，则分别为2．0倍和15倍。DNA序列分析表明，突变株A中海因酶基因为内源突变：即编码氨基酸序列第14位的谷氨酸的密码子由GAA—GAG，第25位的天冬氨酸的密码子由GAT—GAC，两个酸性氨基酸密码子的突变均为使用频率高的密码子变为使用频率低的密码子。而突变株B中产生一个残基突变，即Ala449Gly。我们还对该基因进行了定点突变。将其活性中心的239位的组氨酸残基分别突变为H239Y和H239L，316位的天冬氨酸残基突变为D316E，但突变株酶活性丧失殆尽；若将409位的组氨酸残基变为H409T，活力剩余40％．经(NH4)：SO。分级沉淀

4、、PhenylSepharose疏水层析纯化，PAGE天然胶分析，该酶分子仍然为二聚体，未发生解离现象；将410位的组中文摘要氨酸残基变为H410A，活力基本丧失，仅剩余1．3％，表明相邻二个组氨酸残基在酶分子构象形成过程中所起的作用不同。关键词：D．海因酶；体外定向进化；易错PCR；定点突变；酶活性英文摘要ABSTRACTD-aminoacidsarewidelyusedasintermediatesforthesynthesisofsemisyntheticantibiotics，peptidehormones，pyrethroidsandpesticidesetc．Nowadays，

5、theproductionofD—aminoacidsmostlyreliesonenzymaticconversionintheindustrialfield．Theprocessisthat5'-monosubstitutedhydantoinisfirstlytransferredintotherelevantintermediate，N--carbamy·-D··aminoacidbyD--hydantoinaseandtheresultingN--carbamy—-D—-aminoacidisfurtherconvertedtothecorrespondingD--aminoac

6、idbyN—carbamyolaseorinorganicacid．Therefore，D—hydantoinaseisregardedasakeycatalystinthebioconversionofD—aminoacids．Indeed，allofenzymesaresensiblebypH，temperature，oxidantandSOon，resultingindecreasingorlosingtheiractivity．ToexplorethebettercharacterofD—hydantoinase-producingstrain，amethodofthemolecu

7、le．directedevolutioninvitrowasundertaken．TherandommutationofD-hydantoinasegenewasintroducedbyError-pronePCR．Basedonconditionaltests，threepairsofionswerechosen，i．e．1．5mmol／LMn2++3mmol／LM92+；0．3mmol／L7Mn2++3mmol／LM