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时间：2019-08-24
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1、酶的定向进化主要内容一酶定向进化的概念二酶定向进化的基本过程三基于易错PCR的黄曲酶毒素解毒酶体外分子定向进化概念酶定向进化：是模拟自然进化过程（随机突变、基因重组和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特征的酶的突变体的技术过程。酶定向进化的基本过程随机突变、构建突变基因文库、定向选择常用的随机突变方法1易错PCR技术（error-pronePCR）2DNA重排技术（DNAshuffling）交错延伸PCR技术(StEP)随机引物体外重组技术(RPR)
2、3基因家族重排技术(DNAfamilyshuffling）常用的高通量筛选技术1平板筛选法2荧光筛选法3噬菌体表面展示法4细胞表面展示法5核糖体表面展示法实验基于易错PCR的黄曲霉毒素解毒酶体外分子定向进化结果突变酶A1773：耐高温70℃突变酶A1476：pH4.0稳定性突变酶A2863：pH4.0和pH7.5稳定性易错PCR技术定义：从单一基因出发，通过改变PCR反应条件，在基因扩增过程中使碱基配对出现错误而引起基因突变。过程：双链DNA变性（解链；85－95℃）引物与单链DNA结合（退火；50－70℃）引物延伸（半保留复制
3、；70－75℃）条件：增加Mg2＋（稳定非互补的碱基对）添加Mn2＋（降低聚合酶的特异性）4种底物的浓度不平衡（dATP/dTTP/dCTP/dGTP)易错PCR反应体系（20μL）:10×PCR缓冲液2μLdATP(10mmol/L)和dGTP(10mmol/L)各0.4μL，dCTP(10mmol/L)和dTTP(10mmol/L)各2μL模板pKLAC1-adtz0.2μL上下游引物(10μmol/L)各0.6μLMgCl2(25mmol/L)4.4μLMnCl2(2mmol/L)0、0.8、2、4、6、8μLTaqDNA
4、聚合酶0.2μLddH2O8、6、4、2、0.8、0μL易错PCR突变文库的建立限制性内切酶：XhoⅠ和NotⅠ载体：大肠杆菌-酿酒酵母穿梭分泌表达载体pYES2∕CT∕α-factor(简写为pYCα)连接酶：T4DNA连接酶宿主菌：大肠杆菌DH5α感受态细胞酿酒酵母S.cerevisiaeBJ5465感受态细胞辣根过氧化物酶（HRP）-隐性亮绿（RBG）系统黄曲霉毒素（AFB1）→Ｈ2O2Ｈ2O2+隐性亮绿→亮绿谢谢！
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