酶的定向进化.ppt

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1、第八章酶的定向进化8.1简介通常可通过两条途径获得具有新功能和特性的酶一是从大量未知的生物种系中寻找；二是改造现有已知的酶。人工改造之定点突变首先分析蛋白质的三维空间结构，搞清结构与功能的关系，然后采用定点突变技术改变蛋白质中的个别氨基酸残基，从而得到新的蛋白质，理性化设计。定点突变技术对天然酶蛋白的催化活性、抗氧化性、底物特异性、热稳定性及拓宽酶反应的底物范围、改进酶的别构效应等进行了成功的改造。定点突变的缺点只能对天然酶蛋白中少数的氨基酸残基进行替换、删除或插入，不改变酶蛋白的高级结构，因而对酶

2、功能的改造较有限。本法仅适用于三维结构清楚、结构和功能的相互关系也较清楚的酶。当对酶结构不甚了解时，定点突变就无能为力了.定向进化利用基因的可操作性，模拟自然界的演化进程的非合理设计方案,定向进化(directedevolution)、杂合进化(hybridevolution)等。定义:酶的体外定向进化(invitrodirectedevolution)是在人工模拟自然进化过程的条件下，通过容错PCR、DNA改组、交错延伸技术、随机引物引导重组和递增截短技术等方法对编码酶的基因进行突变和体外重组，经

3、高通量筛选获得性能更优良或全新的酶。本法不需了解酶的结构信息，因此称为非理性化设计。定向进化的历史1萌芽阶段首先在分子水平上进行改造单一分子的是SolSpiegelman在20世纪60年代,利用RNA噬菌体Q进行的试验,目的是证明达尔文的自然选择也可在非细胞体进行.病毒基因组Q复制酶扩增DNA突变库复制快的保留(能被Q酶选择识别的)2奠基阶段1981年，HallBG等报道了他们定向改变了大肠杆菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专一性，开发出对几种糖苷键有水解能力的酶。HallBG等利用lacz缺

4、陷型的菌株为宿主菌，分别在含有某种碳源的培养基上培养．从酶的自发突变库中筛选出分别可以水解半乳糖、乳果糖、乳糖酸的突变酶，而野生型的酶不能水解这些底物。3发展阶段易错PCR(error-pronePCR)和DNA改组方法被成功开发,标志着酶分子定向进化技术的成熟.1992年GramH．等用噬菌体呈现技术体外筛选抗体时，用易错PCR向抗体的重链可变区和轻链可变区引入突变。Stemmer将DNA改组方法引用到酶分子定向进化中，他用β内酰胺酶作为模型分子，对其正向突变库进行DNA改组，以逐渐增加头孢氨噻的

5、浓度为筛选压力，经过三轮DNA改组获得酶活力增加32000倍的突变体。8.2酶的定向进化常用方法一、易错PCR技术为代表的无性进化二、DNA改组技术为代表的有性进化一、易错PCR技术为代表的无性进化无性突变是向单一酶分子基因内随机引入突变，制造突变酶库以便筛选。主要的手段包括易错PCR、盒式诱变、随机定位诱变等易错PCR是在采用Taq酶进行PCR扩增目的基因时，通过调整反应条件，例如提高镁离子浓度，加入锰离子．改变体系中四种dNTP的浓度等，使用低保真度的Taq酶，从而向目的基因中．以一定的频率随机

6、引入突变构建突变库，然后选择或筛选需要的突变体。易错PCR遗传变化只发生在单一分子内部,属于无性进化。较为费力、耗时,一般多用于较小基因片段(<800bp)的改造。通常,经一轮的易错PCR、定向筛选,很难获得令人满意的结果。由此发展出了连续易错PCR(Sequentialerror-pronePCR),将一次PCR扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR扩增的模板,连续反复进行随机诱变,使得每一次获得的少量突变累积而产生重要的有益突变。实例枯草杆菌蛋白酶:洗涤剂合成、鞣革和医药领域的重要工业酶制剂。C

7、hen和Arnold]采用易错PCR对该酶进行了体外进化研究。他们通过降低反应体系中dATP的浓度,对编码该酶从第49位氨基酸到C端的DNA片段进行易错PCR,经筛选得到的几个突变株在高浓度的二甲基甲酰胺(DMF)中酶活性明显提高突变体PC3在60%的DMF中,酶活力是野生型的256倍。将PC3再进行两个循环的定向进化,得到的突变体13M酶活力比PC3还要高3倍。化学诱变剂介导Taguchi等研究表明，用羟胺（hydroxylamine）在65℃下直接处理带有目的基因片段的质粒也可产生随机突变，然后

8、用限制性内切酶切下突变的基因片段，克隆到一定的表达载体中进行功能筛选。应用此技术将带有枯草杆菌蛋白酶基因的质粒进行随机突变，经酶切、克隆表达后得到13个突变株，在10℃下其Kcat/Km比出发菌株提高1倍。由致突变株产生Greener等构建了一株DNA修复途径缺陷的大肠杆菌突变株XL1-Red，其体内的DNA突变率比野生型高出5000倍。将带有拟突变基因的质粒转化到XL1-Red菌株内培养过夜，可产生随机突变，频率一般为1/2000。本法产生的随机突变的特点为：（1）