《酶定向进化》PPT课件

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1、第八章酶定向进化天然酶的局限天然酶的稳定性差,活性低使催化效率很低,还缺乏有商业价值的催化功能天然酶的局限性源于酶的自然进化过程.现代生物工程的要求能具备长期稳定性和活性能适用于水及非水相环境能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物的原材料如何利用相对简单的方法以达到对天然酶的改造或构建新的非天然酶就显得非常有研究意义和应用前景.1993年,美国科学家ArnoldFH首先提出酶分子的定向进化的概念,并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶.酶分子定向进化简称酶定向进化，是模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因

2、的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特征的酶的突变体的技术过程。酶定向进化的基本过程随机突变、构建突变基因文库、定向选择酶定向进化的基本过程：酶基因随机突变构建突变基因文库筛选负突变基因正突变基因进化酶反复进行第一节酶定向进化的特点1.适应面广不需了解酶的结构信息，因此称为非理性化设计。2.目的性强3.效果显著第二节酶基因的随机突变体外随机突变的方法：PCR技术、DNA重排技术、基因家族重排技术基因随机突变方法的特点P207表8－1一易错PCR技术可以通过提高镁离子浓度、添加一定浓度的锰离子、改变4种底物（dAMP、dTMP

3、、dCMP、dGMP）的浓度比等反应条件，使DNA聚合酶在催化基因扩增时，增加碱基配对错误的出现频率，而引起基因突变。特点正突变的概率低，突变基因文库较大，文库筛选的工作量大，一般适用于较小基因的定向进化。实例枯草杆菌蛋白酶:洗涤剂合成、鞣革和医药领域的重要工业酶制剂。Chen等采用易错PCR对该酶进行了体外进化研究。他们通过降低反应体系中dATP的浓度,对编码该酶从第49位氨基酸到C端的DNA片段进行易错PCR,经筛选得到的几个突变株在高浓度的二甲基甲酰胺(DMF)中酶活性明显提高突变体PC3在60%的DMF中,酶活力是野生型的256倍。将PC3再进行两个循环的定向进化,

4、得到的突变体13M酶活力比PC3还要高3倍。二DNA重排技术概念：又称为DNA改组技术，是从正突变基因文库中分离得到的同源DNA，用酶切割成随机片断，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。DNA重排技术的基本过程两条以上正突变基因DNA随机片断突变基因构建突变基因文库筛选负突变基因正突变基因进化酶酶切（反复进行）无引物PCR基因重组酶切三基因家族重排技术又称为基因家族改组技术，是从基因家族的若干同源基因出发，用酶(DNaseⅠ)切割成随机片断，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列发生重新排布而引起基因突变的技术过程。基

5、因家族重排技术的基本过程基因家族若干同源基因酶切DNA随机片断突变基因突变基因文库基因重组筛选负突变基因正突变基因进化酶无引物PCR酶切反复进行DNA家族重排技术与DNA重排技术的异同点相同点：DNA家族重排技术与DNA重排技术的过程大致相同，都要经过基因的随机切割、无引物PCR等步骤以获得突变基因，然后经过构建突变基因文库、采用高通量筛选技术筛选获得正突变基因。不同点：DNA家族重排技术从基因家族的若干同源基因出发进行DNA序列的重新排布，而后者则从采用易错PCR等技术所获得的两个以上的正突变基因出发进行DNA序列的重新排布。第三节酶突变基因的定向选择突变基因的定向选择基

6、本过程突变基因基因载体突变基因文库基因重组筛选目的基因一、构建突变基因文库的主要过程载体的选择1）质粒载体：微生物细胞染色体外，闭合环状双链DNA分子。2）噬菌体DNA载体：由噬菌体DNA改造而成的具有自我复制能力的载体。3）黏粒载体：是一类人工构建的含有λDNA黏性末端和质粒复制子的质粒载体，又称为柯斯质粒。4）噬菌粒载体：是一类人工构建的由M13噬菌体单链DNA的基因间隔区与质粒载体结合而成的基因载体。基因重组在体外通过DNA连接酶的作用，将基因与载体连接在一起形成重组DNA的技术过程。黏性末端连接平头末端连接修饰末端连接形成基因文库将重组DNA转入受体细胞或包装成有感

7、染活性的噬菌体的过程。重组质粒载体：转化重组噬菌体DNA载体：需要用噬菌体外壳蛋白将重组DNA进行包装，称为有感染活性的重组噬菌体，而形成基因文库。二、突变基因的筛选（一）定向选择环境条件的设定（1）提高酶的稳定性，高温筛选重组细胞，每一次突变－筛选的循环中逐步提高重组细胞的培养温度。（2）如果定向进化的目的是提高β－内酰胺酶的活性，从而提高对β－内酰胺酶类抗生素的耐受性，可以通过在含有一定浓度的β－内酰胺酶类抗生素的培养基中培养重组细胞，并在每一次突变－筛选循环中逐步提高抗生素的浓度。（二）高通量筛选技术P217