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1、·518·生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys.2002;29(4)3体外分子定向进化研究进展33徐卉芳 张先恩 张用梅(中国科学院武汉病毒研究所,武汉430071)A.E.G.CASS(ImperialCollegeofScience,TechnologyandMedicine,SouthKensington,LondonSW72AY,UK)摘要 体外定向进化作为近几年发展起来的一种蛋白质改造新策略,可以在未知目标蛋白三维结构信息和作用机制的情况下,通过对编码基因的随机突变、重组和定向筛
2、选,获得具有改进功能或全新功能的蛋白质,使几百万年的自然进化过程在短期内得以实现,因而是发现新的生物活性分子和反应途径的重要方法,已在短短几年内取得了令人瞩目的成就.关键词 体外分子进化,蛋白质工程,DNAshuffling,渐进切割法产生杂和酶(ITCHY),基因组进化学科分类号 Q81 大量定点基因突变实验表明,蛋白质功能和性2 体外定向进化技术的演变和发展质的改变来自于许多小的内部修饰的积累,这些小的修饰或突变分布于较大的序列空间内.人们试图211 错误倾向PCR[2]利用已有的结构生物学信息对蛋白质进行合理设
3、计错误倾向PCR(errorpronePCR)是一种简(rationaldesign),但蛋白质结构的复杂性极大地增便快速地在DNA序列中随机制造突变的方法.其加了合理设计的难度.更何况,对于大多数要改造基本原理是通过改变传统PCR反应体系中某些组的蛋白质来说,我们并不清楚其三维结构信息,不分的浓度,或使用低保真度的DNA聚合酶等,使能进行合理设计.而近年来发展的分子定向进化碱基在一定程度上随机错误引入而创造序列多样性(moleculardirectedevolution)策略属于蛋白质的非文库.本法的关键在于选择适当
4、的突变频率,一般合理设计范畴,它不需要事先了解蛋白质的三维结为每个基因2～5个碱基替换.另外,迭代错误倾构信息和作用机制,而是在体外模拟自然进化的过向PCR可使小的有益突变累积而产生大的提高.[2,3]程(随机突变、重组和选择),使基因发生大量变尽管这种方法已有不少成功的例子,但毕竟遗异,并定向选择出所需性质或功能,从而在几天或传变化只发生在单一分子内部,属于无性PCR进几周内实现自然界需数百万年才能完成的事情.化范畴.212DNAshuffling1 体外分子定向进化的策略DNAshuffling由美国Stemmer
5、于1994年首次[4]定向进化第一步是由一个靶基因或一群相关的提出.该法是对一组基因群体(进化上相关的家族基因起始创建分子多样性(突变和/或重组);DNA序列或曾筛选出的性能改进序列)进行重组然后对该多样性文库的基因产物进行筛选,那些编创造新基因的方法.因为该法在DNA片段组装过码改进功能产物的基因被利用来继续下一轮进化;程中也可能引入点突变,所以它对从单一序列指导重复这个过程直到达到目标.该进化策略有以下三进化蛋白质也是有效的.其基本原理如图1所示.个显著特征:a1进化的每一关键步骤都受到严密这种方法产生的多样性文库
6、,可以有效积累有益突控制.b1除修饰改善蛋白质已有特性和功能外,变,排除有害突变和中性突变,同时也可实现目的[5]还可引入一个全新的功能,来执行从不被生物体所蛋白多种特性的共进化.正是由于该技术包括要求的反应;甚至为生物体策划一个新的代谢途3中国科学院与英国皇家学会联合资助项目(Q174).[1]径.c1能从进化结果中探索蛋白质结构和功能的33通讯联系人.基本特征.Tel:027287641492,E2mail:x.zhang@pentium.whiov.ac.cn 收稿日期:2002201207,接受日期:20022
7、03204©1995-2006TsinghuaTongfangOpticalDiscCo.,Ltd.Allrightsreserved.2002;29(4)生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys.·519·了DNA重新组装的过程,使它与以往的诱变技术合成体系缓冲系统可兼容,组装前无需纯化操作.有了质的不同.当DNAshuffling用来重组一套进d1随机引发DNA合成不受模板DNA长度的限制,化上相关的基因时,又被称为familyshuffling,一便利了小肽的改造.个突出的例子是shuf
8、fling4种头孢菌素酶基因,酶215 过渡模板随机嵌合生长活增加了270～540倍,而单基因shuffling只增加过渡模板随机嵌合生长(randomchimeragenesis[6][9]了8倍.ontransienttemplates,RACHITT)技术是与DNAshuffling概念上明显不同的、改进的基因家族重组技术.
