分子定向进化技术简介课件.ppt

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1、分子定向进化技术分子定向进化moleculardirectedevolution1分子定向进化技术1234主要内容分子定向进化技术的概述及定义分子定向进化技术的原理分子定向进化技术具体过程分子定向技术的应用及展望2分子定向进化技术人们试图利用结构生物信息学和定点突变技术对蛋白质进行合理的改造，这些方法难度较大且要在了解蛋白质的三维空间的基础上才能进行。而分子定向进化技术是在不需了解相关蛋白的三维空间结构的情况下在体外模拟自然进化的过程(随机突变、重组和选择)，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质或功能的

2、蛋白。概述3分子定向进化技术生物在漫长的时间里经过自发突变(突变与重组)，通过自然选择，逐渐形成了多样性的生物。基因在短时间通过人为引发突变，经过人工筛选，形成满足人们需要的新功能或者优良性能生物物质(酶蛋白)。分子定向进化自然进化自发、不定向、自然选择、慢人为、定向、人工选择、快4分子定向进化技术一、分子定向进化技术的定义分子定向进化(moleculardirectedevolution)是在分子水平研究所需生物的特定基因或蛋白质，是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化机制，使进化朝着人们需要的方向发展其

3、实质，是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。5分子定向进化技术二、分子定向进化技术的过程原理6分子定向进化技术通常通常一个典型的定向进化技术涉及三步:通过随机突变和(或)基因体外重组创造基因多样性，即将目的蛋白的编码基因进行突变或是随机重组产生一个含有多个基因的突变体库。2.导入适当载体后构建突变文库；3.通过高通量的筛选方法，选择阳性突变子。这个过程可重复循环，直至得到预期性状的酶。7分子定向进化技术1.基因的体外突变无性进化：◆易错PCR；◆物理、化学方法介导的随机诱变；◆由致突变菌株产生的随机突变。

4、有性进化：◆DNA改组技术；◆随机引物体外重组法；◆重叠延伸法。三、分子定向进化的具体选择策略8分子定向进化技术易错PCR(ErrorPronePCR)利用PCR过程中出现的碱基错配，对特定基因进行随机诱变的技术。9分子定向进化技术◆向反应体系中掺入核酸类似物(如次黄嘌呤核苷酸)◆限制其中一种核苷酸的用量，使聚合酶优先选择其他三种，从而增加错配率。◆通过引物5’端引入错配碱基，插入或缺失一个或多个碱基。这种突变方法是靶向的，突变发生在DNA模板上预先确定的位置。向PCR反应体系中引入突变的方法：10分子定向

5、进化技术在TaqDNA聚合酶催化的PCR反应体系中加入一定量的Mn2+替代天然的辅助因子Mg2+，由于TaqDNA聚合酶缺乏校对活性(3’-5’外切酶活性)，其错配率会大大增加，通常可以达到每千碱基对1个突变左右。可以通过调节核苷酸、酶、镁离子等的用量，并加入锰离子等来控制错配的程度。11分子定向进化技术连续易错PCR(Sequentialerror-pronePCR)将第一次PCR扩增的有益突变作为下一次PCR扩增的模板，这样连续反复随机诱变，使得每次获得的少量突变进行积累而得到更重要的有益突变。12分子

6、定向进化技术重叠延伸PCR(SOE-PCR)原理：重叠延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可简单迅速的将两个DNA片段连在一起，用于融合基因的构建。13分子定向进化技术5，5，3，3，5，A基因B基因3，5，abcd●●●●●●●●●●分子定向进化技术a.不需要设计酶切识别位点，可将不同来源的DNA识别位点连接起来构建融合基因；b.不需要经过接头处理连接酶，利用PCR拼接基因；c.可进行高保真定点、定

7、位突变，并且突变和重组可以同时进行；d.容易产生随机突变，需要对PCR反应条件进行优化。特点15分子定向进化技术16分子定向进化技术DNA改组技术(DNAshuffling)又称有性PCR，指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组。通过改变单个基因(或基因家族)原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。17分子定向进化技术●从突变体基因库中分离出来的DNA片段用脱氧核糖核酸酶I随机切割●得到的随机片段经过不加引物的多次PCR循环●在PCR循环过程中，随机片段之间互为模板和引物进行扩

8、增，直到获得全长的基因，这导致来自不同基因片段之间的重组。18分子定向进化技术基因家族改组技术(familyshuffling)19分子定向进化技术1.DNaseI产生随机片段；2.随机片段变性；3.随机片段复性；4.延伸(重复2-4步)20分子定向进化技术几种不同突变方法产生的突变积累的情况比较21分子定向进化技术随机引物体外重组法(RPR)RPR法是用一套随机序列引物,产生互补于模板不同位点的短DNA片段库(