蛋白质分子定向进化简介

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1、蛋白质分子定向进化简介文/赖福春【摘要】定向进化是改进蛋白功能与活性的有效手段，主要是在实验室里模拟自然进化过程，由易错PCR、DNA改组、随机引导重组和交错延伸技术等方法进行诱变与突变基因体外重组，设计高通量筛选方法来选出需要的突变株。其对研究蛋白质的结构与功能的关系具有重大意义。本文综述了定向进化技术的发展及应用。.jyqkan等最先提出分子水平上的体外定向进化思想，在随后几十年,通过各国生物学家和其他各界科学家的努力，这一思想转变为现实，并融入到人类生产的领域。　定向进化是近20年发展起来的

2、一项新技术，是达尔文的进化思想在核、肽或蛋白质等分子水平上的延伸和应用。蛋白质定向进化是人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对蛋白质基因进行改造，产生基因多样性，在结合定向筛选（或选择）技术，获得所需性能大幅提高的突变体。定向进化是利用Taq-DNA聚合酶不具有3′→5′校对功能的性质，并结合基因工程现有技术手段，在待进化蛋白的PCR扩增反应中，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，并构建突变库。凭借定向的选择方法，选出所需性质的突变体，从而排除其他突变体。定向进化的基

3、本规则是:“获取所筛选的突变体”。与自然进化不同，定向进化是人为制造特殊条件，模拟自然进化机制，使进化过程定向进行，整个进化过程完全是在人为控制下进行的,使蛋白质分子朝向人们期望的特定目标进化。二、定向进化的基本方法1.易错PCRLeung等人发明了该技术。易错PCR（error-pronePCR）是一种简便快速的在DNA序列中随机制造突变的方法。其基本原理是通过改变传统PCR反应体系中某些组分的浓度(如Mg2+的浓度)、调整4种dNTP的浓度或使用低保真度的Taq-DNA聚合酶等，使碱基在一定程

4、度上随机错误引入而创造序列多样性文库。2.改组DNA改组技术由美国人Stemmer于1994年提出。DNA改组（DNAshuffling）又称有性PCR（sex-ualPCR），是将目的基因在DNaseI的作用下随机酶切成小片段，再通过PCR重组将这些小片段进行PCR反应，并重新组装全长的基因。DNA改组过程中也可能引入新的点突变。因此，DNA改组可以有效地从单一基因系列开始进行蛋白质的定向进化。DNA改组克服了易错PCR只能发生点突变而不能进行系列小区域间交换的缺点，大大提高进化效率。DNA改组

5、被认为是继DNA重组之后的又一代基因工程技术。DNA改组有以下优点：（1）DNA改组可在短时间内通过重组有效的突变体发掘所有可能的重组体与突变序列，从而大大加快进化速度；而且对可操作的靶序列没有任何要求，长度可以达到几十kb；（2）通过多轮筛选或选择，可以使有益突变迅速积累，导致功能的明显提高；（3）DNA改组从表型上早期进行选择，而不必了解DNA片断上序列的信息，简化了操作程序；（4）DNA改组比随机突变显著提高了良性突变的概率。3.外显子改组外显子改组（exonshuffling）类似于DNA

6、改组，两者都是在各自含突变的片段之间进行交换，它特别适合于真核生物，自然界中不同分子的外显子发生同源重组，导致不同外显子结合，是产生新蛋白的重要途径之一。4.随机引发重组1998年，Arnold提出了一种有效的新方法——随机引发重组（RPR）。随机引发重组的原理是：以单链DNA为模板，配合一套随机引物先产生大量互补于模板不同位点的DNA小片段，由于碱基的错配和错误引发，这些DNA小片段中会有少量的点突变，在DNA聚合酶作用下，经过反复的热循环可重新组装成全长基因克隆到表达载体上，随后筛选。5.交错

7、延伸技术1998年，Arnold等人建立了一种新的体外重组方法——交错延伸技术。交错延伸是在PCR反应体系中把常规的退火和延伸合并为一步，在热循环中大大缩短退火与Taq-DNA聚合酶催化延伸的时间。从而合成出短的新生链，在随后反复进行变性和短暂复性、延伸过程，直到产生完整的基因长度，最终形成全长杂合基因突变库。由于模板的转换，大多数多核苷酸含有不同亲本的序列信息。该方法的基因重组程度可通过控制反应条件和时间予以调节，仅需在一个反应管中进行,简化了有性PCR操作。6.酶法体外随机-定位诱变该方法是对

8、目的基因采用随机突变增加突变位点，以减少筛选突变体的工作量。它通过控制DNA合成底物种类和浓度比例实现碱基对的错配。7.定向进化的其他方法近几年，又相继出现了一些定向进化的新方法，如临时模板随机嵌合技术、外显子洗牌技术、SCRATCH技术、随机插入/缺失突变、渐增切割法产生亲和酶和酵母增强组合文库。需要说明的是：以上所表述的重组技术，任何一种都有缺陷。在实际应用中，应该针对具体的问题，选择合适的技术，以达到最佳的效果。蛋白质分子定向进化技术在一定程度上弥补了定点突变技术的不足，极大