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1、进入夏天，少不了一个热字当头，电扇空调陆续登场，每逢此时，总会想起那一把蒲扇。蒲扇，是记忆中的农村，夏季经常用的一件物品。 记忆中的故乡，每逢进入夏天，集市上最常见的便是蒲扇、凉席，不论男女老少，个个手持一把，忽闪忽闪个不停，嘴里叨叨着“怎么这么热”，于是三五成群，聚在大树下，或站着，或随即坐在石头上，手持那把扇子，边唠嗑边乘凉。孩子们却在周围跑跑跳跳，热得满头大汗，不时听到“强子，别跑了，快来我给你扇扇”。孩子们才不听这一套，跑个没完，直到累气喘吁吁，这才一跑一踮地围过了，这时母亲总是，好似生
2、气的样子，边扇边训，“你看热的，跑什么？”此时这把蒲扇，是那么凉快，那么的温馨幸福，有母亲的味道！ 蒲扇是中国传统工艺品，在我国已有三千年多年的历史。取材于棕榈树，制作简单，方便携带，且蒲扇的表面光滑，因而，古人常会在上面作画。古有棕扇、葵扇、蒲扇、蕉扇诸名，实即今日的蒲扇，江浙称之为芭蕉扇。六七十年代，人们最常用的就是这种，似圆非圆，轻巧又便宜的蒲扇。 蒲扇流传至今，我的记忆中，它跨越了半个世纪，也走过了我们的半个人生的轨迹，携带着特有的念想，一年年，一天天，流向长长的时间隧道，袅第九章-分
3、子定向进化一、酶定向进化发展历史定向进化是近20年发展起来的一项新技术，是达尔文的进化论思想在核酸、肽或蛋白等分子水平上的延伸和应用。它不需要深入了解蛋白质的结构功能关系，在实验室条件下人工模拟生物大分子自然进化过程，在体外对基因进行随机诱变，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质的突变体，从而可以在短时间内实现自然界几百万年才能完成的进化过程。二、理性设计寡核苷酸引物介导的定点突变PCR介导的定点突变盒式突变优点:目的基因可插入到噬菌体衣壳蛋白编码基因内,通过噬菌体表面展示技术可方便地筛选出重
4、组子。不足之处:(1)对19种氨基酸须分别设计各自寡核苷酸引物,费用较大;(2)大肠杆菌宿主细胞存在自身修复系统,因突变修复而难以筛选出突变子;(3)不适合多点饱和突变。2、盒式诱变该法利用一种含有突变靶位点和特殊酶切位点序列的密码子盒(codoncassette)来引入突变序列。由于密码子盒可从正反两方向插入目的基因,因此只须11种密码子盒就可替换产生全部20种氨基酸以达到点饱和突变的效果。该法突出优点是:一个靶位点两侧的酶切位点经过改造可替换成其它氨基酸,相对于寡核苷酸定向诱变而言节省了引物合
5、成的费用,而且可对多个非邻近位点同时进行点饱和突变。不足之处是:(1)每个靶位点两侧需分别设计酶切位点;(2)密码子盒两端存在重复序列,因自连而增加突变子筛选难度。3、基于PCR的点饱和突变1）、突变引物诱变当靶位点位于基因两端时,可设计这样一对引物扩增目的基因,正向引物为靶位点突变的兼并引物,反向引物为目的基因序列引物。突变引物诱变是基于PCR的点饱和突变中最简单、最快速的方法,但难以对基因中间的靶位点进行点饱和突变。2）、重叠延伸PCR设计一对简并引物,使其在靶位点附近有一定程度的重叠(图2中
6、的B、C引物),分别与基因5′和3′端引物(图2中的A、D引物)组合,扩增含突变靶位点的上游片段和下游片段,然后将上下游片段在靶位点处交错,互为模板重叠延伸成全长基因。图2重叠延伸PCR技术流程A、D分别表示基因上下游引物；B、C分别表示靶位点正反向突变引物；基因上的黑色区域为靶位点，NNN表示兼并引物或突变核苷酸该法主要优点:(1)能方便地对基因中间的靶位点进行点饱和突变,解决中间靶位点不易突变的难题;(2)突变与重组同时完成,大大缩短实验周期;(3)不存在突变修复问题,容易筛选出全部突变子;(
7、4)可方便地进行多点饱和突变。不足之处是:当靶位点靠近目的基因末端时,分段扩增的片段过小而不易回收;分别扩增上下游片段时,不能使用具有无模板加尾性能的polI型耐热DNA聚合酶,而应使用无加尾性能的高保真α型或混合型耐热DNA聚合酶。3、质粒扩增诱变在靶位点处设计一对反向兼并引物,扩增质粒全长片段,然后用DpnI消化含甲基化位点的亲本链,新合成链由于没有甲基化位点而被保护。由于此法需要扩增质粒全长序列,因此在PCR反应中应特别注意扩增的保真性,一般采用高保真α型或混合型耐热DNA聚合酶。常用点饱和
8、突变技术特性的比较三、非理性设计—蛋白质（酶）定向进化（一）进化策略特征：（1）进化的每一关键步骤都受到严密控制。（2）除修饰改善蛋白质已有特性和功能外，还可引入一个全新的功能，来执行从不被生物体所要求的反应；甚至为生物体策划一个新的代谢途径；（3）能从进化结果中探索蛋白质结构和功能的基本特征。（二）定向进化常用方法1.易错PCR为代表的无性进化2.DNA改组技术为代表的有性进化3.基因家族之间的同源重组4.杂合酶(1)杂合酶(2)构建策略1、易错PCR是一种简便快速地在DNA序列
