产黄青霉苯乙酰coa连接酶的研究和定点突变

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1、捅嘤摘要青霉素属于p一内酰胺类抗生索，囡其疗效好，抗菌活性强，对人体细胞毒性小且价格低廉而广泛应用，是目前治疗感染性疾病的重要药物。产黄青霉是一种丝状真菌j是青霉素的生产用菌，以a．氨基已二酸、半胱氨酸和缬氨酸为原料的青霉素生物合成途径已有详细的阐述，通过菌种改良以获得更高产量是工业生产的重要课题。苯乙酰CoA连接酶(PCL)在青霉素合成途径中，催化苯乙酸与CoA反应生成苯乙酰CoA，苯乙酰CoA再在异青霉素N酰基转移酶(IAT)的催化下，与6．APA反应生成青霉素G。敲除了产黄青霉中编码PCL的基因(p办，)，青霉素的合成量

2、明显减少，因此，苯乙酰CoA连接酶是青霉素G生物合成途径中，增加苯乙酸侧链前体物质利用效率的重要酶之一。因此，克隆产黄青霉的苯乙酰CoA连接酶基因，并进行异源表达，可以为研究该酶的催化作用机制、酶的性质、对青霉素合成的影响以及代谢工程改造青霉素生产菌株奠定基础。本实验采用RT．PCR方法，从产黄青霉中克隆了苯乙酰CoA连接酶(肋，)基因，构建了pET30a节办，表达质粒，并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了活性表达，经Ni-NTA亲和层析柱纯化了蛋白，研究了PCL的基本性质。本研究主要研究成果如下：1、本文克隆了产黄青霉中础

3、，基因，构建了pET30a中乃，表达质粒i并在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达。在16℃低温诱导下，SDS凝胶电泳出现一条分子量约为601①a的明显条带，与报道的苯乙酰CoA连接酶酶蛋白的理论分子量62．1kDa一致。重组质粒pET30a节厅，在BL21(DE3)中表达的酶活达到1680U／mL。2、本文克隆的产黄青霉中p办，基因所编码的苯乙酰CoA连接酶，通过序列分析以及结构预测，其氨基酸序列与NCBI数据库中多个产黄青霉的苯乙酰CoA连接酶(登录号分别为：XM002565364．1，AJ001540．1，NW00302

4、0081．1，AM920437．1，AM048877．1)1oo％同源，与彳妒P馏f，，淞．向m喀口，“sA佗93(x】L7538932)、№Ds口，．，D巧旧加幽P，．fNRRL181()(I’_001259941．1)、彳妒P馏f，，材sD仳口PRJB40(XP一001823173．1)月妒P馏f，，螂加V船N砌U3357(XP—002378509．1)、爿印P馏f，，螂c肠’’口，凇NRRL1(XP—001274067．1)、彳印P馏f，，Ⅳs陀，．旭wNlH2624(XP-ool216727．1)达到70％以上同源。3

5、、纯化酶PCL的基本性质：最适温度是30℃：有一定的热稳定性；最适pH为8．0：pH7．0．8．5酶比较稳定。4、采用重叠延伸PCR法(()ve卜lapexlensi【)nPCR，OE．PCR)，实现PCL定点l突变，获得G337S突变子、G337D突变子、G337K哭变子、G337F突变子、G337H突变子、A338S突变子、A338D突变子、A338K突变子、A338F突变子和A338H突变子，用于研究酶的底物特异性。产黄青霉p厅，白勺克隆及其在大肠杆菌中的表达，为进一步研究该酶的结构，通过定向进化，提高酶的窿化活性或改变

6、酶的底物特异性，为青霉素生产茵的遗传改造及其组合生物合成学的研究奠定了基础。关键词苯乙酰CoA连接酶基因(p办，)；基因克隆；表达；纯化；产黄青霉；RT-PCR；定点突变；重叠延伸PCRAbstractPenic订linbelongstop-lact锄antibioticsanditisakindofimponantdrugtotreatinfectiousdiseasesbecauseofitSgoode佑cacy，srong粕tibacterialactiVity，littetoxic埘tohumallcellsaIldm

7、elowprice．’尸P，2fcfⅣf“聊c向，：瞪ogP，l“，"whichispenicillinproducingstrainis1Fil锄entous如ngus．Thepenicillinbiosynthesispatllwayin尸P玎纪埘f“所c办伊9矽mf卅withthe0【-aminoadipicacid，cycteineandValine嬲rawmateria】’haSbeendescribedindetail．PhenylacetylCoAligase(PCL)inthepenicillinbiosynt

8、hesis，whichcatalyzesreactionofPAAandCoAi11ordertogeneratephenylacet)，l—CoA．Then，IATcatalyes也ereactionofphenylacetyl—CoAand6一APAtogeneratep