曲霉cj22-326产壳聚糖酶基因克隆、表达和定点突变

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1、摘要壳聚糖酶可以专一性地水解壳聚糖，生成在很多领域都有着广泛应用的低聚壳聚糖。但是已报道的微生物产壳聚糖酶的酶活力普遍较低。本实验室从大海淤泥中成功筛选到了一株产壳聚糖酶菌株曲霉CJ22．326。此菌株可以在壳聚糖诱导培养基中产内切壳聚糖酶(CSN)和外切壳聚糖酶(csx)。为了进一步提高壳聚糖酶的活力，本研究运用分子生物学的方法，对酶的基因进行了克隆和表达并对重组酶进行了定点突变研究。本论文首先对CJ22．326进行了菌种的分子生物学鉴定。使用真菌通用引物NSl和NS8，以基因组DNA为模板，PCR扩增得到了曲

2、霉的18srDNA序列。对PCR产物进行鉴定和测序，结果发现CJ22—326与曲霉属的Aspergillusnige^Aspergillusproliferans，以及青霉属的Penicilliumexpansum和PenicilliumchrysogenumKCTC6052等菌株的相似性均达到了96％。但是根据孢子形态特征，发现它不属于其中任何的菌种，我们认为它是曲霉属的新菌种。利用3'-RACE(rapidamplificationofcDNAends)和5'-RACE的方法，使用简并引物，扩增得到了编码曲霉

3、CJ22．326内切壳聚糖酶的cDNA，对其结构进行分析，根据分析结果设计了一对特异引物，成功扩增到了编码曲霉CJ22．326内切壳聚糖酶cDNA的结构基因(717bp)，此基因序列已在Genbank数据库申请登记，登记号为EU302818。为了获得曲霉CJ22．326外切壳聚糖酶的编码序列，利用RT-PCR的方法，扩增得到了编码外切壳聚糖水解酶的cDNA。根据eDNA序列分析结果，进一步扩增出了来源于曲霉CJ22．326的外切壳聚糖水解酶的编码序YU(2652bp)。该序列已在Genbank数据库申请登记，登记

4、号为FJ449570。将内切壳聚糖酶和外切壳聚糖酶的eDNA结构基因分别插入到大肠杆菌表达载体pET．28a(+)中，构建重组质粒pET28a-CSN和pET28a-CSX。将重组载体pET28a-CSN转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，重组菌在IPTG诱导下表达出有活性的重组内切酶，经SDS．PAGE检测和Western．blot鉴定，重组大肠杆菌有分子量约为29kDa的蛋白表达带。采用不同的温度和IPTG诱导浓度，对重组内切酶的表达条件进行了优化。发现当温度为37℃，IPTG诱导浓度为1mM时，蛋

5、白质的表达量最高。重组质粒pET28a-CSX转化大肠杆菌BL2l(DE3)pLysS中之后，在IPTG诱导下表达出有活性的重组外切酶，SDS．PAGE和Westem．blot检测到约100kDa的蛋白表达带。使用Ni．NTA亲和层析对重组内切酶和重组外切酶进行了亲和纯化，分别得到了2．3mg／L和1．2mg／L蛋白质。使用DNS法对重组内切酶和重组外切酶的酶活力进行了测定，分别为1．18U／mL和6．96U／mL。通过测定酶解液体系的粘度和对酶解产物的薄层层析分析，发现重组酶CSN以内切的方式水解壳聚糖的D．(

6、1，4)糖苷键。而重组酶CSX是以外切的方式作用于壳聚糖的分子一端，依次切下氨基葡萄糖残基。对重组酶的酶学性质进行研究，结果表明：重组内切酶的最适pH值是6，最适反应温度是65℃，‰和‰缸分别为0．826mg／ml和0．094摘要mg／ml·min；重组外切酶的最适pH值是4．1，最适反应温度是50℃，‰和‰“分别为0．146mg／ml·min和7．758mg／ml。重组内切酶和重组外切酶具有高度的底物专一性，除了对不同脱乙酰度的壳聚糖有作用以外，对几丁质和CMC没有水解活力。两者的反应速率均随着底物脱乙酰化度的

7、提高而增加。运用定点突变的方法，对保守的谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)进行定点突变后，发现Glul69和Aspl60在突变后完全丧失了内切壳聚糖酶的活力。使用圆二色谱对野生酶与突变酶的二级结构进行研究，发现E169Q的结构和野生酶以及其它保持一定活力的突变酶(D160E)基本保持一致。关键词：曲霉；内切壳聚糖酶；外切．p．D．氨基葡萄糖苷酶；克隆；表达；His—Tag纯化；定点突变IIAbstractChitosanaseshydrolyzechitosanintochitooligosaccharides，whi

8、chhaveVariOUSapplicationsinmanyareas．However，theactivityofmicroorganismchitosanasewaslowaccordingtothereports．OurlabgotastrainAspergillussp．CJ22-326fromtheseamud，whichcouldproduceendo-chi