产黄青霉苯乙酰coa连接酶的研究和定点突变论文

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1、捅嘤摘要青霉素属于p一内酰胺类抗生索,囡其疗效好,抗菌活性强,对人体细胞毒性小且价格低廉而广泛应用,是目前治疗感染性疾病的重要药物。产黄青霉是一种丝状真菌j是青霉素的生产用菌,以a.氨基已二酸、半胱氨酸和缬氨酸为原料的青霉素生物合成途径已有详细的阐述,通过菌种改良以获得更高产量是工业生产的重要课题。苯乙酰CoA连接酶(PCL)在青霉素合成途径中,催化苯乙酸与CoA反应生成苯乙酰CoA,苯乙酰CoA再在异青霉素N酰基转移酶(IAT)的催化下,与6.APA反应生成青霉素G。敲除了产黄青霉中编码PCL的基因(p办,),青霉素的

2、合成量明显减少,因此,苯乙酰CoA连接酶是青霉素G生物合成途径中,增加苯乙酸侧链前体物质利用效率的重要酶之一。因此,克隆产黄青霉的苯乙酰CoA连接酶基因,并进行异源表达,可以为研究该酶的催化作用机制、酶的性质、对青霉素合成的影响以及代谢工程改造青霉素生产菌株奠定基础。本实验采用RT.PCR方法,从产黄青霉中克隆了苯乙酰CoA连接酶(肋,)基因,构建了pET30a节办,表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了活性表达,经Ni-NTA亲和层析柱纯化了蛋白,研究了PCL的基本性质。本研究主要研究成果如下:1、本文克隆了

3、产黄青霉中础,基因,构建了pET30a中乃,表达质粒i并在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达。在16℃低温诱导下,SDS凝胶电泳出现一条分子量约为601①a的明显条带,与报道的苯乙酰CoA连接酶酶蛋白的理论分子量62.1kDa一致。重组质粒pET30a节厅,在BL21(DE3)中表达的酶活达到1680U/mL。2、本文克隆的产黄青霉中p办,基因所编码的苯乙酰CoA连接酶,通过序列分析以及结构预测,其氨基酸序列与NCBI数据库中多个产黄青霉的苯乙酰CoA连接酶(登录号分别为:XM002565364.1,AJ001540.

4、1,NW003020081.1,AM920437.1,AM048877.1)1oo%同源,与彳妒P馏f,,淞.向m喀口,“sA佗93(x】L7538932)、№Ds口,.,D巧旧加幽P,.fNRRL181()(I’_001259941.1)、彳妒P馏f,,材sD仳口PRJB40(XP一001823173.1)月妒P馏f,,螂加V船N砌U3357(XP—002378509.1)、爿印P馏f,,螂c肠’’口,凇NRRL1(XP—001274067.1)、彳印P馏f,,Ⅳs陀,.旭wNlH2624(XP-ool216727.1

5、)达到70%以上同源。3、纯化酶PCL的基本性质:最适温度是30℃:有一定的热稳定性;最适pH为8.0:pH7.0.8.5酶比较稳定。4、采用重叠延伸PCR法(()ve卜lapexlensi【)nPCR,OE.PCR),实现PCL定点l突变,获得G337S突变子、G337D突变子、G337K哭变子、G337F突变子、G337H突变子、A338S突变子、A338D突变子、A338K突变子、A338F突变子和A338H突变子,用于研究酶的底物特异性。产黄青霉p厅,白勺克隆及其在大肠杆菌中的表达,为进一步研究该酶的结构,通过定

6、向进化,提高酶的窿化活性或改变酶的底物特异性,为青霉素生产茵的遗传改造及其组合生物合成学的研究奠定了基础。关键词苯乙酰CoA连接酶基因(p办,);基因克隆;表达;纯化;产黄青霉;RT-PCR;定点突变;重叠延伸PCRAbstractPenic订linbelongstop-lact锄antibioticsanditisakindofimponantdrugtotreatinfectiousdiseasesbecauseofitSgoode佑cacy,srong粕tibacterialactiVity,littetoxic埘

7、tohumallcellsaIldmelowprice.’尸P,2fcfⅣf“聊c向,:瞪ogP,l“,"whichispenicillinproducingstrainis1Fil锄entous如ngus.Thepenicillinbiosynthesispatllwayin尸P玎纪埘f“所c办伊9矽mf卅withthe0【-aminoadipicacid,cycteineandValine嬲rawmateria】’haSbeendescribedindetail.PhenylacetylCoAligase(PCL)i

8、nthepenicillinbiosynthesis,whichcatalyzesreactionofPAAandCoAi11ordertogeneratephenylacet),l—CoA.Then,IATcatalyes也ereactionofphenylacetyl—CoAand6一APAtogeneratep

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