蛋白定向进化及应用进展

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1、维普资讯http://www.cqvip.com中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2008年第29卷第1期65蛋白定向进化及应用进展袁宁，胡又佳，朱春宝(上海医药工业研究院，上海200437)摘要：目的作为对自然进化的体外模拟，定向进化是改进蛋白功能与活性的有效手段。定向进化的成功与否取决于突变体库的多样性以及筛选方法的效率。目前已发展出多种创造和筛选突变体的策略及手段，并将定向进化的对象从蛋白延伸到有机体，使定向进化在许多领域得到了广泛的应用。关键词：定向进化；DNA改组；全基因

2、组改组；高通量筛选中图分类号：TQ931文献标识码：A文章编号：1005—1678(2008)01—0065—04ProgressindirectedevolutionofproteinanditsapplicationYUANNing，HUYou-jia，ZHUChun—bao(ShanghaiInstituteofPharmaceuticalIndustry，Shanghai200437，China)随着现代生物科技的突飞猛进，以蛋白质为核心的产品1突变体库的构建或技术在科研、工农业生产、医药卫生、环保等领域中正发挥体外定向进化的第一步是

3、构建包含大量突变的基因文着越来越重要的作用。为了使蛋白质产品能够更好地满足库，通常采用无性突变和(或)有性重组的方式来进行。需求，人们一方面在不断发掘新的活性蛋白质，另一方面也1．1无性突变开始将目光投向对现有蛋白质的改造。无性突变是指发生在单一分子内部的突变，目前多采用在自然界，生命的进化和新功能的获得需要通过突变、易错PCR(error-pronePCR，EP-PCR)的方法来进行，即利用重组和适者生存等过程来实现，而在实验室中进行的蛋白质TaqDNA聚合酶无校正功能的特点，通过提高M浓度、调改造正是对这一过程的模仿：首先创造突变文库，然

4、后采用整4种dNTP的浓度、使用Mn2或采用低保真Taq酶等，来增选择或筛选的方法从中挑选出满足特定要求的突变体。由加错误碱基渗入的几率，达到引入多点突变的目的⋯。不于目的蛋白质的特性是预先设定好的，因此这一改造过程被过，由于EP-PCR的突变是随机的并且突变来源局限于分子称为“定向进化(directedevolution)”。内部，从而造成有益突变的比例远远低于有害突变并且正突按照创造突变的方式，定向进化可采取随机、半理性和变的幅度较小，因此它已较少单独用于蛋白质改造。理性等策略来进行。理性和半理性策略是在弄清蛋白质空此外，近年来还发展出了

5、一些新的无性突变策略，如随间结构，特别是活性位点和构效关系的基础上，针对活性位机插入．删除突变(randominsertion／deletionmutagenesis，RID)、点来设计和改造蛋白质。而通常所说的“定向进化”则多指序列饱和突变(sequencesaturationmutagenesis，SeSaM)、致突变采用随机方式构建包含大量突变的文库并对之进行定向筛菌株产生随机突变等，也有一些可产生高频率突变的商品化选的过程。由于这一策略在不需要了解蛋白质空间结构和工具问世，这些都丰富了无性突变的手段。构效关系的情况下就能获得所需的性质

6、和功能，因此也是目1．2有性重组前应用较多的蛋白质改造手段。有性重组是对自然进化中基因重组的体外模拟，不过有随着分子生物学技术的不断发展，特别是PCR和基因重赖于PCR及相关技术，原本漫长的自然突变和重组过程被极组技术的应用，定向进化已从在体内转为在体外进行，实验度缩短，甚至只需几十个小时就能人为创造出海量的突变体方法也变得简便、快速和高效，而高通量筛选和体外展示技库，并且有益突变的比例显著高于无性突变，这无疑极大拓术的发展更进一步拓展了体外定向进化的应用范围，使一些展了定向进化的操作空间。原本操作起来耗时耗力或难以进行直观筛选的蛋白质分子通

7、过体外重组进行有性突变的手段有很多，最初的方法也能够得到改造。在此，本文对突变体库的构建和筛选、定来自于Stemmer在1994年所建立的DNA改组(DNAshuf-向进化的延伸及其在各领域的应用进展等进行综述。fling)J，又称有性PCR(sexualPCR)或分子育种(molecularbreeding)，并且这也是至今最常用的技术，而随后发展起来的收稿日期：2007—05—22方法或多或少都与此有关。作者简介：袁宁(1977一)，男，江苏南京人，博士研究生，主要从事微生物与生化药学研究；朱春宝，通信作者，研究员，博士生导师，1．2．1

8、单基因改组最初用于改组的对象是单个基因，首Tel：021—62479808—323，E—mail：zhucb@sipi．CORI．cn。先用DNaseI将其随机切割