赫赛汀修饰的自然杀伤细胞在体内外对乳腺癌细胞的作用及其机制研究

《赫赛汀修饰的自然杀伤细胞在体内外对乳腺癌细胞的作用及其机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分类号：R730.51学校代码：10062密级：学号：2014601044博士学位论文DOCTORALDISSERTATION论文题目：赫赛汀修饰的自然杀伤细胞在体内外对乳腺癌细胞的作用及其机制研究TITLEStudyontheeffectandmechanismofHerceptin-armedNKcellstobreastcancercellsinvitroandinvivo一级学科：临床医学二级学科：肿瘤学论文作者：田潇导师：任秀宝教授天津医科大学研究生院二〇一六年五月分类号：R730.51学校代码：10062密级：学号：2014

2、601044学位类别：科学学位专业学位学科门类：医学博士学位论文DOCTORALDISSERTATION论文题目：赫赛汀修饰的自然杀伤细胞在体内外对乳腺癌细胞的作用及其机制研究TITLEStudyontheeffectandmechanismofHerceptin-armedNKcellstobreastcancercellsinvitroandinvivo一级学科：临床医学二级学科：肿瘤学论文作者：田潇导师：任秀宝教授导师组成员：于津浦研究员天津医科大学研究生院二〇一六年五月I中文摘要背景：在世界范围内，乳腺癌已经成为女性的最常见

3、恶性肿瘤。乳腺癌细胞表面高表达人类表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2,HER2)，其与乳腺癌患者的不良预后密切相关。赫赛汀是一种人源化的靶向HER2的免疫球蛋白G1(immunoglobulinG1,IgG1)型单克隆抗体，临床上已作为一线药物用于HER2阳性的乳腺癌患者的治疗。在实际应用中，虽然赫赛汀与化疗方案联合，可以有效提高病情缓解率，延长肿瘤进展时间以及患者生存期，但赫赛汀相关心脏毒性，以及易产生耐药抵抗现象，限制了其临床应用。现今，自然杀伤细胞(naturalkille

4、rcell,NKcell)治疗已经逐渐成为临床上极具潜力的免疫治疗方案。我们前期研究发现白细胞介素-2(interlukin-2,IL-2)和IL-15的细胞因子组合方案可以成功地在体外扩增NK细胞，但对于NK细胞杀伤活性的提高效果不明显。近来有文献指出，在体外对淋巴细胞应用赫赛汀进行刺激，可使淋巴细胞具有更强的杀伤效能。目的：本研究在现今已成熟的NK细胞培养体系中加入了赫赛汀，观察其对NK细胞的扩增、杀伤、迁移及粘附能力的影响及其相关机制，并在临床开展试验性治疗观察其安全性和有效性。方法：临床采集20例乳腺癌患者的外周富集血，分离外周

5、血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)，加入到提前用赫赛汀(实验组),或IgG1(同型对照组)包被的培养瓶中，用IL-2与IL-15细胞因子联合培养方案在体外进行15天连续培养。培养结束后用磁珠分选的方法纯化扩增产物中的NK细胞以进行后续实验。在初始以及第15天计数培养体系中细胞总数。分别在培养的第0天，第5天，第10天，第15天应用流式细胞术，标记NK细胞，测定体系中CD3-CD56+NK细胞占总扩增产物中的百分比，并圈定CD56dimNK细胞与CD56brightNK细胞并分析其比例。

6、在第15天将NK细胞分别与HER2阳性或阴性的乳腺癌细胞进行共培养，检测乳腺癌细胞中乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)的释放水平、NK细胞表面CD107a脱颗粒水平和干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)的分泌量，以评价纯化的NK细胞在体外对乳腺癌细胞的杀伤能力。利用活细胞工作站在显微镜下动态观察不同培养方案扩增出的NK细胞与乳腺癌细胞共培养时的相互作用；用趋化因子芯片检测用不同培养方案扩增出的NK细胞与乳腺癌细胞共培养后上清液中多种趋化因子水平。在培养的II第0天，第5天，第10天及第15天测定

7、NK细胞细胞表面活化受体NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D和DNAM-1表达水平和表面分子CD16表达水平，以及用二抗检测赫赛汀和IgG1的残留情况；用蛋白质印迹法(westernblotting，WB)检测赫赛汀对NK细胞上CD16下游传导通路上关键蛋白表达及活化水平，如SYK、PI3K、VAV、RAC、ERK。最后对6例乳腺癌患者进行用赫赛汀修饰的NK细胞(Herceptin-armedNKcells,HA-NKs)的试验性治疗，初步观察临床安全性和有效性。结果：体外大规模培养15天后，赫赛汀组的总扩增产物的细胞数为(1

8、.15±0.30×109)，与IgG组(0.90±0.41×109,p=0.06)和空白组(1.06±0.50×109,p=0.40)相比未见显著性差异。与空白对照组(43.00±13.66%，18.57±