激发型cd28单抗参与的细胞因子诱导的杀伤细胞(cik)及其对乳腺癌细胞的杀伤作用研究

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1、苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签日期：丝!主：Z：望荆I大学学位论文1吏用授权声日月＼嗍嬲本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的

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3、细胞(cytokine--inducedkiller，CIK)是将人体(自体或异体)外周血单个核细胞在体外经多种细胞因子刺激后活化增殖的一群异质性细胞群。它具有增殖能力强、杀瘤活性高、抗瘤谱广及不受MHC(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)限制性等特点。特别是对术后清除微小转移灶、防止扩散及复发，提高患者自身抗肿瘤免疫能力具有重要作用。CD28是表达于人类T细胞以及部分NK细胞表面的重要分子，T细胞的CD28作为受体分子与抗原提呈细胞(antigenpresentingce

4、ll，APC)表达的B7分子结合介导T细胞活化所需的协同刺激信号，从而激发T细胞的增殖与发挥免疫效应。激发型的CD28抗体与CD28分子结合后可直接转导细胞活化信号，进而促进细胞的增殖与发挥免疫效应。本研究旨在自行制备鼠抗人激发型CD28单抗的基础上，联合不同细胞因子体外诱导CIK细胞，分析该法诱导的CIK的增殖能力、表型特征及对乳腺癌细胞株MCF-7的杀伤作用，以期寻找安全、高效扩增CIK的新方案。第一部分鼠抗人激发型CD28单克隆抗体的制备及鉴定目的：制备鼠抗人激发型CD28单克隆抗体并鉴定其生物学功能。

5、方法：将已建株的分泌鼠抗入激发型CD28单克隆抗体的杂交瘤细胞大量体外扩增，采用体内诱生腹水法制备单抗并经ProteinA亲和层析分离纯化。间接免疫荧光法鉴定单克隆抗体的效价，流式细胞术分析单克隆抗体对细胞膜型CD28分子的结合能力。结果：腹水形成率约为80％，腹水收获量为2ml／只。腹水经纯化后的抗体蛋白得率为1．5mg／ml。纯化抗体用于间接免疫荧光检测的用量为0．5“g／5x105细胞。结论：制备的激发型CD28单克隆抗体能够良好地结合抗原分子。中文摘要激发型CD勰单抗参与的细胞因子诱导的杀伤细胞(CI

6、K)及其对乳腺癌细胞的杀伤作用研究第二部分激发型CD28单抗参与诱导的CIK及其表型分析目的：研究激发型CD28单抗参与诱导的CⅨ的扩增能力及细胞表型特征方法：采用Ficon分离法获取健康人外周血单个核细胞(PBMC)，调整浓度为2x106／1111后，接种于24孔培养基，lml／孑L。按以下两组添加诱导剂：A、ami℃D3+IL-2+球N—y；B、anti℃D3+anti℃D28+IL-2+刀FN—y。诱导剂的终浓度ami℃D3为1“幽[Ill、anti℃D28为O．5斗g／IIll、几乏为O．1万单位／l

7、Ill、圈FN吖为100n洲。隔2-3日换液或扩瓶。于第7天经细胞计数计算各孔细胞数量；同时采用流式细胞术单标记法分析两组诱导方案下CⅨ表面CD4、CD8及CD56的表达，流式细胞术双标记法分析CⅨ表面CD4／CD25、CD8／CD25、CD4原asL、CD8／FasL的表达。结果：培养至第7天，激发型CD28单抗组cIl(的细胞总量平均为8．2×106／孔，明显高于对照组的2．8×106／孑L，差异具有统计学意义(P

8、T细胞及CD56+细胞分别为68．4士6．1％、34．6土7．2％及15．1士3．9％，与对照组的52．5士3．6％≮26．9士2．7％及7．7士1．2％比较均具有显著统计学差异(P