mtor通路通过cd44促进神经元再生的内在机制的研究

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1、mTOR通路通过CD44促进神经元再生的内在机制的研究ResearchonmTORpathwaythroughtheCD44topromoteneuronalregenerationintheinnermechanism作者姓名：张继伟专业名称：人体解剖与组织胚胎学指导教师：刘佳梅教授学位类别：医学硕士答辩日期：2015年5月27日前言中枢神经系统神经损伤的后果往往比较严重，其神经损伤的主要特点包括神经细胞的死亡及其轴突的损坏，同时还会伴随发生相应的神经信号通路的传导功能障碍。目前针对神经损伤类疾病，临床治疗措施主要包括改

2、善神经再生微环境和干细胞移植两个方面，前者通过调节受损部位营养因子的分泌或降低胶质细胞抑制性分子的表达等措施为神经再生营造出适宜的微环境[1]，后者通过移植不同来源的干细胞来补充受损神经元增加再生轴突的数量[2]。然而，上述这些治疗手段虽然取得一定成效，但是受损轴突再生的长度却十分有限，神经功能恢复的程度依然无法令人满意。究其原因，主要是由于单纯改善受损神经元外在环境或补充干细胞数量并没有从根本上增强中枢神经元自身的再生能力(intrinsicregrowthability)。大量实验数据表明，增强神经元内在再生能力是神经

3、损伤治疗中不可缺少的关键环节，因此，越来越多的研究者开始将注意力转向神经元内在再生能力调节的机制研究[3,4]。Akt/mTOR/Ps6K信号转导分子通路有控制神经元的分化[5]，神经元发育[6]，神经轴突再生[7,8]的能力。研究表明mTOR是决定神经元内在再生能力的重要因素，mTOR的活性上调后，中枢神经系统神经元的生长能力及受损后神经元的再生能力都显著增强。但是mTOR促进神经再生的具体的机制不清，其下游信号分子通路及相关机制还有待于进一步研究证实。CD44分子作为细胞外基质的一种受体，几乎表达于所有的细胞表面，包括

4、神经细胞[9]，但是它在神经系统的功能却知之甚少。但是的确有文献表明CD44与神经轴突的发育密切相关：CD44蛋白与骨桥蛋白和层粘连蛋白相互作用可促进中枢神经系统神经元轴突生长，参与视网膜神经节细胞的轴突生长延伸。Hsieh等人的实验结果证明在前列腺癌中，CD44分子位于mTOR通路下游，那么在神经系统中，CD44是否为mTOR激活后下游通路中调节神经元内在生长机制的关键分子？根据以上文献我们推测CD44是mTOR激活后下游通路中调节神经元内在生长机制的关键分子之一，本文拟对此展开研究，探讨激活mTOR通路是否通过CD44

5、分子表达上调从而促使中枢神经系统神经元轴突生长。I中文摘要mTOR通路通过CD44促进神经元再生的内在机制的研究神经损伤类疾病的治疗一直是困扰医学界的一大难题。目前，治疗神经损伤类疾病的方法大体包括细胞的替代治疗和改善神经受损后局部抑制性的微环境两个方面。由于中枢神经系统神经元损伤后再生失败的原因错综复杂，上述治疗手段的效果往往不能从根本上解决问题。因此，阐明神经元内在再生能力的机制，探究神经损伤轴突再生的相关通路仍然是神经损伤类疾病治疗的关键。本实验通过体外诱导SH-SY5Y细胞分化，使其具有成熟神经元的特征，从而用作本

6、研究的体外神经细胞模型。通过用RNA干扰技术下调分化SH-SY5Y细胞中PTEN基因表达，从而使mTOR通路激活，检测相关CD44分子表达是否上调及其与轴突生长的内部联系，进一步探讨mTOR通路是否通过CD44分子促进轴突生长，进而提高神经元的再生能力。方法：体外培养SH-SY5Y细胞，并用10μM全反式维甲酸(RTRA)诱导分化3d，用倒置显微镜观察诱导组SH-SY5Y细胞形态变化情况，并设立对照组。利用RT-PCR及免疫组织化学染色技术检测实验诱导组与对照组SH-SY5Y细胞微管相关蛋白(Microtubuleasso

7、ciatedproteinMAP2)表达及转录情况，进而验证实验组与对照组细胞分化程度的差异；随后对分化成熟的细胞进行PTENRNAi实验，利用荧光显微镜对各实验组细胞进行观察，检测实验干扰组的荧光转染效率；利用RT-PCR技术对干扰24h后各实验组细胞PTEN的转录水平进行检测；利用westernblot技术对干扰36h后磷酸化核糖体(Ps6K)蛋白与雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达水平进行检测；利用RT-PCR技术检测CD44转录水平，并与对照组进行比较，观测CD44表达水平与轴突生长关系是否呈现正相关；将诱导后的细胞同

8、时进行PTEN与CD44基因的共同干扰，并观察两种基因转录共同下调后，细胞轴突的长度变化情况。结果：RT-PCR结果证实诱导3d的细胞与对照组相比较，MAP2的转录水平明显上调。免疫组织化学方法证实，诱导3d的细胞与对照组相比较MAP2阳性细胞数明显增加。随后我们用RNAi技术对诱导分化的SH-SY5Y