吴茱萸碱通过mTOR信号通路引起人胃癌SGC-7901细胞凋亡的作用机制.pdf

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1、贵阳医学院2011届硕士研究生毕业论文目录摘要„„„„„„„„„„„„„„2前言„„„„„„„„„„„„„„4材料与方法„„„„„„„„„„„„6结果„„„„„„„„„„„„„„18讨论„„„„„„„„„„„„„„28参考文献„„„„„„„„„„„„„32英文摘要„„„„„„„„„„„„„35致谢„„„„„„„„„„„„„„36略缩词表„„„„„„„„„„„„„37论文原创性声明„„„„„„„„„„39附：综述„„„„„„„„„„„„40-1-贵阳医学院2011届硕士研究生毕业论文吴茱萸碱通过mTOR信号通路引起人胃癌SGC-7901细胞凋亡的作用机制专业：临床检验诊断学研究生：刘

2、鑫导师：黄韵祝教授黄海副教授摘要【目的】研究吴茱萸碱诱导细胞凋亡的胱天蛋白酶非依赖途径（caspase-independent）——哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR信号转导通路作用机制，进一步阐明吴茱萸碱的药理作用，为临床治疗和联合用药奠定理论基础。【方法】体外培养人胃癌SGC-7901细胞，1.5µmol/L吴茱萸碱、1.5µmol/L吴茱萸碱和20µmol/L胱天蛋白酶抑制剂（z-VAD-fmk）分别作用于SGC-7901细胞24h:①0.4%台盼蓝监测细胞活力；②MTT比色法观察吴茱萸碱作用胃癌SGC-7901细胞和人体外周血单个核细胞(humannormalperiphera

3、lbloodmononuclearcells，PBMCs)的细胞毒作用；③DNA梯形条带检测细胞凋亡；④Real-timePCR检验mTOR、p70S6K和4EBP1基因的表达情况，采用β-actin作对照；⑤WesternBlotting检测mTOR和p-mTOR蛋白表达变化情况，Tublin-α作为内参。⑥AnnexinV-FITC/PI双染细胞，利用流式细胞仪观察雷帕霉素（rapamycin）作用胃癌SGC-7901细胞48h后测定细胞凋亡率。【结果】①0.4%台盼蓝测细胞活力>95%；②MTT结果显示，吴茱萸碱诱导SGC-7901细胞凋亡存在时间剂量依赖性，且对人类PBMC

4、s无细胞毒作用；③DNA梯形条带显示吴茱萸碱可诱导凋亡细胞DNA断裂，且z-VAD-fmk可抑制与胱天蛋白酶相关的凋亡；④Real-timePCR结果显示吴茱萸碱、吴茱萸碱与胱天蛋白酶抑制剂可使SGC-7901细胞内的mTOR、p70S6K和4EBP1基因表达减低，组间存在显著性差异（P＜0.05），且加抑制剂后阻断胱天蛋白酶作用后，吴茱萸碱的抑制作用加强；⑤WesternBlotting结果显示吴茱萸碱可以抑制mTOR和p-mTOR蛋白的表达无论是否有z-VAD-fmk的参与，但是加抑制剂z-VAD-fmk阻断胱天蛋白酶作用后，吴茱萸碱的抑制率增强；⑥流式分析，与对照组（1640

5、培养基组）比较，rapamycin浓度为1ng/L作用SGC-7901细胞48h后，早期凋亡率无差异，10ng/L、100ng/L早期凋亡率分别为6.85%、11.98%。存在显著性-2-贵阳医学院2011届硕士研究生毕业论文差异（P＜0.05）。【结论】吴茱萸碱可能通过mTOR信号途径促进SGC-7901细胞凋亡。关键词：吴茱萸碱；SGC-7901细胞；凋亡；mTOR信号途径；rapamycin-3-贵阳医学院2011届硕士研究生毕业论文前言吴茱萸为芸香科吴茱萸属植物吴茱萸、石虎及疏毛吴茱萸的干燥近成熟果[1]实，味苦性温,有小毒，归肝、脾、胃、肾经，主要含多种生物碱、挥发油、[

6、2]苦味素等化学成分，作为中国传统的中药，许多研究表明吴茱萸对心血管系统、消化系统、中枢神经系统、免疫系统等有药理作用，具有止痛、止吐、止血、收敛、收缩子宫、强心和降血压，抗肿瘤等作用。吴茱萸碱是自中草药吴茱萸中分离出的最主要的、具有生物活性的生物碱之一。近年来，关于吴茱萸碱抗肿瘤作用成为人们研究的热点，吴茱萸碱可以通过[3-7][8-9]阻滞细胞周期、影响细胞骨架而促进肿瘤细胞凋亡。研究发现，吴茱萸具有很强的抗肿瘤活性，包括耐药细胞株。尽管如此，吴茱萸诱导细胞凋亡的分子机制仍未能阐述完全。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR又称FRAP(FK506-bindingproteinl2an

7、drapamycinassociatedprotein)，由于其羧基末端与磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）催化区高度同源，mTOR被认为是PI3K相关的蛋白激酶家族成员，mTOR可随后磷酸化它的两个下游分子，即真核细胞起始因子elF-4E结合蛋白1(4E-BP1)和核糖体蛋白S6激酶p70S6K。4E-BP1磷酸化后失活因而降低与elF-4E的结合能力使elF-4E与之分离，与其他翻译起始因子结合，启动蛋白质的翻译。而[10]p70S6K磷酸化后激活其功能，促进蛋白质