胶质瘤细胞中adar2 mrna前体选择性剪接模式的分析及bcl-x剪接转换寡核苷酸诱导胶质瘤细胞凋亡的实验研究

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1、胶质瘤细胞中ADAR2mRNA前体选择性剪接模式的分析及Bcl-x剪接转换寡核苷酸诱导胶质瘤细胞凋亡的实验研究AnalysisalternativesplicingpatternofADAR2pre-mRNAinhumangliomacelllines,andapoptosis-promotingeffectofsplice-switchingoligonucleotidestargetingBcl-xpre-mRNAonhumangliomacelllines作者姓名：李朝晖专业名称：外科学研究方向：神经外科指导教师：田宇教授学位类别：医学博士培养单位：吉林大学中日联谊医院论文答辩

2、日期：2015年05月20日授予学位日期：年月日论文评阅人：答辩委员会组成姓名职称工作单位姓名职称工作单位朱树干教授山东大学齐鲁医院主席：王任直教授北京协和医院毛庆教授四川大学华西医院委员：胡锦教授上海华山医院李晓萌教授东北师范大学周余来教授吉林大学药学院张凯教授首都医科大学房学迅教授吉林大学生命科学院刘恩重教授哈尔滨医大一院赵兴利教授吉林大学中日联谊医院台桂香教授吉林大学基础医学院中文摘要第一部分胶质瘤细胞中ADAR2mRNA前体选择性剪接模式的分析目的：比较胶质瘤细胞U87、U251、A172和正常星形胶质细胞HA1800中ADAR2mRNA前体选择性剪接模式的差别。方法：RT-

3、PCR产物测序检测胶质瘤细胞和正常胶质细胞中GluR2Q/R位点的A-to-I编辑水平；Real-timePCR方法检测ADAR2mRNA的表达量；RT-PCR及测序比对检测胶质瘤细胞中ADAR2mRNA前体的选择性剪接位点，根据鉴定出的选择性剪接位点设计特异性引物，Real-timePCR方法检测胶质瘤细胞U87、U251、A172和正常星形胶质细胞HA1800中不同剪接转录本的相对表达量，比较胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中ADAR2mRNA前体剪接模式的差异。结果：胶质瘤细胞U87、U251、A172中GluR2Q/R位点的A-to-I编辑水平明显下降（P＜0.01），ADAR2

4、mRNA总的表达量没有显著变化（P＞0.05）。在胶质瘤细胞U87、U251、A172和正常星形胶质细胞HA1800中均检测到ADAR2mRNA前体有3个剪接位点：第1个剪接位点位于外显子-1和外显子1之间，产生Exon1a；第2个剪接位点导致Exon2缺失；第3个剪接位点位于催化活性区域，引起Exon5a的插入。其中第3个位点的剪接水平在胶质瘤细胞和正常胶质细胞中存在差异。Real-timePCR检测，胶质瘤细胞U87、U251、A172中Exon1a(-)/Exon1a(+)、Exon2(-)/Exon2(+)比值与正常星形胶质细胞HA1800中Exon1a(-)/Exon1a(

5、+)、Exon2(-)/Exon2(+)比值比较，无显著性差异（P＞0.05）；胶质瘤细胞U87、U251、A172中Exon5a(-)/Exon5a(+)比值和正常星形胶质细胞中Exon5a(-)/Exon5a(+)比值比较，显著降低（P＜0.01）。结论：胶质瘤细胞中GluR2Q/R位点的A-to-I编辑水平明显下降。胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中ADAR2mRNA前体均有3个剪接位点。其中Exon5a位点的剪接在胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中存在明显差别，Exon5a(+)转录本的表达增加可能是导致胶质瘤细胞中ADAR2编辑活性下降的原因。关键词胶质瘤；RNA编辑；选择性剪接；

6、RT-PCRI第二部分Bcl-x剪接转换寡核苷酸诱导胶质瘤细胞凋亡的实验研究目的：比较胶质瘤细胞U87、U251、A172和正常星形胶质细胞HA1800中Bcl-xmRNA前体选择性剪接模式的差异。探讨Bcl-x剪接转换寡核苷酸（Bcl-xSplice-switchingoligonucleotides，Bcl-xSSO）对胶质瘤细胞株U251增殖和凋亡的影响。方法：RT-PCR、real-timePCR结合Westernblot方法检测胶质瘤细胞U87、U251、A172和正常星形胶质细胞HA1800中Bcl-xL和Bcl-xS的相对表达量，比较胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中Bcl

7、-xmRNA前体选择性剪接模式的差异。设计靶向Bcl-x基因下游选择性5’端剪接位点的剪接转换寡核苷酸Bcl-xSSO，β-globinSSO作为阴性对照SSO。SSO经2’-甲氧乙基(2’-O-methoxyethyl，MOE）、全硫代磷酸化（phosphorothioate，PS）修饰。用脂质体将SSO转染至U251细胞。采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）检测Bcl-xSSO对U251细胞的增殖抑制率。流式细胞术定量检测U251细胞的凋亡率。RT-P