bcl-x选择性剪接微基因报告方法的建立

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1、Bcl-x选择性剪接微基因报告方法的建立黄波基金项目：国家自然科学基金（No.30700338）作者简介：黄波，男，1983年生，南昌大学2007级硕士研究生，Email：jxmuhb666@sohu.com。通讯作者：王小中，男，副教授，研究方向为白血病分子诊断，Email：wangxzlj@126.com。，王小中1，王彩纹1，李静2，章海斌1，熊火梅1，肖芸1，余佳3（南昌大学：1第二附属医院检验科，2第一附属医院检验科，江西南昌330006；3DepartmentofDermatology,TheFeinbergschoolofMedicine,NorthwesternUniv

2、ersity,Chicago,IL60611,USA）【摘要】目的：构建凋亡相关基因bcl-x微基因（minigene）及针对其重要顺式作用元件B2G,CRCE2的突变微基因，建立bcl-x微基因报告法并应用于bcl-x选择性剪接机制的研究。方法：首先用PCR从K562细胞基因组DNA中扩增出Bcl-x基因外显子2及内含子2的5′端部分序列片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(-)中，然后扩增出Bcl-x基因内含子2的3′端及外显子3部分序列，定向插入上一片段下游，构建成pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因。另外，以pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因为模板，利用反向PC

3、R法构建突变微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x-B2G（M）,pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE2（M）。应用微基因及其突变微基因瞬时转染HL-60细胞，通过RT-PCR测定细胞中bcl-xL/bcl-xSmRNA水平的变化。结果：所克隆的bcl-x微基因及其突变微基因无一错误突变。在HL-60细胞中，bcl-x顺式作用元件B2G,CRCE2对bcl-xL/bcl-xS有一定影响。结论：成功构建人类凋亡相关基因Bcl-x的微基因及其突变微基因，顺式作用元件B2G缺失使bcl-xS几乎消失，CRCE2突变使bcl-xL/bcl-xS上升。【关键词】微基因报告;微基因;突变

4、微基因;bcl-xL/bcl-xS;选择性剪接Establishmentoftheminigenemethodforreportingthealternativesplicingofbcl-x[Abstract]AIM：Toconstructthebcl-xminigeneanditsmutagenesisminigenestargetingitscis-elementscalledB2G、CRCE2,establishingtheminigenereportforfuturestudingthealternativesplicingofbcl-x.METHODS：AtFirst,am

5、plifiedthefragment(P1P2)includingexon2andpartof5‘sequenceofintron2inbcl-xgenebyPCRfromhumanleukemiacellK562genomicDNA,Then,directionallyinsertedthefragmentintotheplasmidpcDNA3.1(-),wecalleditpcDNA3.1(-)-p1p2;andthesecond,weamplifiedthefragment(P3P4)including3’sequenceofintron2andpartofexon3inbcl

6、-xgene,thendirectionallyinsertedthefragmentintothedownstreamoffragmentp1p2,wecalleditpcDNA3.1(-)-p1p2-p3p4,itispcDNA3.1(-)-bcl-xminigene.Ontheotherhand,weutilizedpcDNA3.1(-)-bcl-xminigeneastemplatetoconstructitsmutagenesisgenecalledpcDNA3.1(-)-bcl-x-B2G(M)、pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE2(M)byinversePCR.

7、WeintroducedtheminigeneanditsmutagenesisminigenestothecellHL-60bytransientinfection,anddetectedthevariationofbcl-xL/bcl-xSinmRNAlevel.RESULTS：Thebcl-xminigeneanditsmutagenesisminigenethatweclonedabosolutlycorrect,havingnonef