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1、Bcl-x选择性剪接微基因报告方法的建立黄波基金项目:国家自然科学基金(No.30700338)作者简介:黄波,男,1983年生,南昌大学2007级硕士研究生,Email:jxmuhb666@sohu.com。通讯作者:王小中,男,副教授,研究方向为白血病分子诊断,Email:wangxzlj@126.com。,王小中1,王彩纹1,李静2,章海斌1,熊火梅1,肖芸1,余佳3(南昌大学:1第二附属医院检验科,2第一附属医院检验科,江西南昌330006;3DepartmentofDermatology,TheFeinbergschoolofMedicine,NorthwesternUniv
2、ersity,Chicago,IL60611,USA)【摘要】目的:构建凋亡相关基因bcl-x微基因(minigene)及针对其重要顺式作用元件B2G,CRCE2的突变微基因,建立bcl-x微基因报告法并应用于bcl-x选择性剪接机制的研究。方法:首先用PCR从K562细胞基因组DNA中扩增出Bcl-x基因外显子2及内含子2的5′端部分序列片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(-)中,然后扩增出Bcl-x基因内含子2的3′端及外显子3部分序列,定向插入上一片段下游,构建成pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因。另外,以pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因为模板,利用反向PC
3、R法构建突变微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x-B2G(M),pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE2(M)。应用微基因及其突变微基因瞬时转染HL-60细胞,通过RT-PCR测定细胞中bcl-xL/bcl-xSmRNA水平的变化。结果:所克隆的bcl-x微基因及其突变微基因无一错误突变。在HL-60细胞中,bcl-x顺式作用元件B2G,CRCE2对bcl-xL/bcl-xS有一定影响。结论:成功构建人类凋亡相关基因Bcl-x的微基因及其突变微基因,顺式作用元件B2G缺失使bcl-xS几乎消失,CRCE2突变使bcl-xL/bcl-xS上升。【关键词】微基因报告;微基因;突变
4、微基因;bcl-xL/bcl-xS;选择性剪接Establishmentoftheminigenemethodforreportingthealternativesplicingofbcl-x[Abstract]AIM:Toconstructthebcl-xminigeneanditsmutagenesisminigenestargetingitscis-elementscalledB2G、CRCE2,establishingtheminigenereportforfuturestudingthealternativesplicingofbcl-x.METHODS:AtFirst,am
5、plifiedthefragment(P1P2)includingexon2andpartof5‘sequenceofintron2inbcl-xgenebyPCRfromhumanleukemiacellK562genomicDNA,Then,directionallyinsertedthefragmentintotheplasmidpcDNA3.1(-),wecalleditpcDNA3.1(-)-p1p2;andthesecond,weamplifiedthefragment(P3P4)including3’sequenceofintron2andpartofexon3inbcl
6、-xgene,thendirectionallyinsertedthefragmentintothedownstreamoffragmentp1p2,wecalleditpcDNA3.1(-)-p1p2-p3p4,itispcDNA3.1(-)-bcl-xminigene.Ontheotherhand,weutilizedpcDNA3.1(-)-bcl-xminigeneastemplatetoconstructitsmutagenesisgenecalledpcDNA3.1(-)-bcl-x-B2G(M)、pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE2(M)byinversePCR.
7、WeintroducedtheminigeneanditsmutagenesisminigenestothecellHL-60bytransientinfection,anddetectedthevariationofbcl-xL/bcl-xSinmRNAlevel.RESULTS:Thebcl-xminigeneanditsmutagenesisminigenethatweclonedabosolutlycorrect,havingnonef