synaptotagmin+ⅰ基因选择性剪接与rna编辑的进化与功能分析

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1、浙江大学生命科学学院硕士学位论文SynaptotagminⅠ基因选择性剪接与RNA编辑的进化与功能分析姓名：吕剑宁申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：金勇丰20080610中英文摘要中文摘要真核生物RNA的成熟通常需要经历复杂的转录后加工过程，其中包括修饰、异构、剪接和编辑等。选择性剪接在真核生物蛋白质组的扩容以及新增功能的赋予中起着重要的作用。选择性剪接的多种形式在功能调控水平上受到的重视与日俱增，特别是通过改变生物大分子局部结构的细微调控对重要功能产生的影响。本论文对无脊椎动物特别是昆虫中的synaptotagmfnI(sytl)基因(ortholog

2、)的选择性剪接现象进行了系统分析，除了验证前人发现的剪接位点并不保守外，进一步鉴定到一更为保守的串联选择性剪接位点。同时在蚊子的sytI同源基因中发现剪接补偿的新现象，即当一个剪接位点消失时会通过另一个剪接位点的出现实现对功能调控的回馈。蜜蜂sytf的同源基因在相对保守的串联剪接位点上，第二个剪接受体发生了G到A的突变(其它物种均为G)，失去选择性剪接的能力。为了验证该位点在进化上的保守性，我们运用了定点突变的手段(site-directedmutagenesis)将A突变为G，制作用于研究剪接的minigene，通过体外转录与剪接实验，发现了选择性剪接的重现，证明该位点在

3、昆虫synaptotagmin，基因中确实是保守的，只是某些物种在基因组水平上的突变造成选择位点的缺失。．同源建模表明C2B功能域上插入的2-3个氨基酸会在1inker区域增加一个alpha螺旋结构。为了进一步验证该位点通过剪接对SytI蛋白在功能上的影响，我们通过同源建模对两种剪接形式的蛋白结构进行了预测，通过结构的差异预测到短肽的插入或缺失可能对该功能结构域的阳离子结合能力有一定的影响。另外我们对SytI经过RNA编辑的C2B结构域的功能进行了一定的探索，胰蛋白酶限制性消化结果明，编辑对蛋白质稳定性有一定的帮助。关键词：转录后加工，选择性剪接，RNA编辑，定点突变，体内

4、剪接nAbstractMaturationofeukar)roticRNAusuallydependsonratherdelicateandcompleXpost-transcriptionalprocesses，includingresidualmodificatio吣of0咖atlon，addition，editing，splicingandsoon．Alternativesplicingtakesactiverolesinproteomeextenslon，aswellasconferringnovelfunctionstomacromolecules·Various

5、typesofaltematlVesplicingp撇rnsonregulatoryaspecthavedrawnmoreandmore甜entlonstromscientists，especiallytheirimpactontinyfunctionaltuningthroughchangingregionalstructureofbiomolecules．Neuronalsystemisoneofthemostcomplicatedonenotonl-Yinanatomlclevel,butalsoinmolecularlevel．Theabundanceoffunct

6、ionalmoleculesandthec。mplexltyo主regulatorynetwork，bringaboutbothrobustnessandefficiencY·P0st-traIlscriptlonalpr。cessingisals。。fgreatsignificancetonormalfuncti。n。fmissy≥tem·。，BaseonDreviousdiscoveryofalternativesplicingphenomenainthesynaptotagmlnlgenefromAplysi口c删硎c口，thisthesistriestotakeab

7、roadeIIViewonaltematlVespiicingeVentsofinvertebratesynaptotagminIorthotogsfromeV0iutIonaryaspectusingholometabolousinsectsasmaterials．InadditiontothepreViousaltematlVesDlicingsite(siteA)withtwo3’splicingacceptorchoices，anoVelandrelatlVemoreconsen，ed劬ughoutspei