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1、胶质瘤细胞中干细胞分离的实验研究何麟蔡洪刘谊陈忠邹昆良邓功建(四川达州市中心医院635000)【中图分类号】R73-3【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2012)30-0072-03【摘要】目的研宄应用无血清培养基悬浮法培养U-251胶质瘤细胞系的方法;并分离该细胞系中的脑肿瘤干细胞，鉴定其特异性标志物CD133+的表达并观察其生长和分化特征。方法应用培养大鼠神经干细胞的培养基和培养方法，在无血清培养基中釆用悬浮法培养人U-251胶质瘤细胞系；再将分离获得的悬浮生长的脑肿瘤干细胞利用免疫
2、荧光法检测脑肿瘤干细胞特异性标志物CD133+在脑肿瘤干细胞球中的表达。再将脑肿瘤干细胞接种于含血清培养基，观察其分化生长和分化特征。结果U-251胶质瘤细胞系中有约(2.56±0.2)%的肿瘤细胞在无血清培养基中能够存活，增殖，形成自由漂浮的细胞球；其细胞表达CD133+神经干细胞的标志物，并可连续传代，若重新接种于含血清培养基中可重新贴壁分化，贴壁分化后细胞形态与直接在含血清培养基中培养的U-251胶质瘤细胞系无明显差别。结论用悬浮无血清培养法从U-251人胶质瘤细胞系中成功培养出脑
3、肿瘤干细胞，其肿瘤干细胞能够产生为多种细胞形态的分化细胞，脑肿瘤干细胞的分离培养成功对脑肿瘤的基础和临床研究具有重要价值【关键词】U-251人胶质瘤细胞系脑肿瘤干细胞悬浮法培养无血清培养基脑肿瘤居成人恶性肿瘤发病率前十位，其发病率和死亡率不断升高，严重地威胁着人类健康和生命。虽然外科手术和其他治疗措施进展很快，但仍很难治愈，经手术(放疗和化疗治疗后，病人几乎无一例外地出现肿瘤复发。在过去的20多年中，脑胶质瘤的治疗一直无明显进展［1］，最近研宄发现，脑肿瘤中存在着具有干细胞自我更新特性的细胞亚群即脑肿
4、瘤干细胞(braintumorstemcell,BTSC),是引发肿瘤并维持脑肿瘤的生长的细胞来源(tumor-initiatingcell,TIC),在肿瘤的复发过程中起着决定性的作用［2］。肿瘤干细胞(cancerstemcells)是存在于肿瘤中含量较少的具有干细胞性质的细胞群体，它具有自我更新的能力，是形成不同分化程度的肿瘤细胞和肿瘤不断扩大的根源。肿瘤干细胞的消火就意味着消火了肿瘤。本实验中,我们使用成分相对简化成本较低的无血清培养基，应用悬浮培养NSC(Neuralstemcells,NS
5、C)的实验方法，从U-251中成功分离培养出具有增殖形成BTS能力和分化能力的BTSC并连续传代。这种悬浮培养方法简便快捷，能奋效地分离和传代BTSC,为BTSC的深入研究提供了材料。1材料和方法1.1材料U-251(人胶质瘤细胞)：由跶明医学院附属第一医院免役治疗中心提供,表皮生长因子(购买于PEPROTECHEC公司)，硷性成纤维生长因子(购买于PEPROTECHEC公司)，DMEM/F12(购买于GIBCO公司)，N2添加剂(购买于GIBCO公司)，CD133一抗(购买于SIGMA公司)，L-谷
6、氨酰胺(购买于AMRESCO公司)，羊抗小鼠IG-FITC二抗(购买于昆明W吉尔科技有限公司)。1.2方法1.2.1细胞培养基俾统含血清培养基(serum-supplementedmedium,SSM)为含10.00%小牛血清的DMEM/F12(1：1)培养基，并添加L-谷氨酰胺(2mmol/L胰岛素(4u/L),青霉素G(l×105u/L),链霉素(100mg/L),无血清培养基(serum-freemedium,SFM),为不含胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基，并添加重组人
7、表皮生长因子(epide-rmalgrowthfactor,EGF,PeproTech)、重.组人碱性成纤维生长因(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF,PeproTech)、其它成分同上。1.2.2U-251中BTSC的分离培养与传代先将U-251接种于传统SSM中，在培养瓶中传代。待细胞处于对数生长期，用D-Hanks液清洗，胰酶(0.25%)消化，自制巴斯德吸管机械吹打成单细胞悬液，悬于SFM,台盼兰染色并计数，以l×106孔接种于6孔板，在37°C、5.
8、00%,饱和湿度培养箱中培养。待BTSC增殖形成肿瘤干细胞球(braintumorsphere,BTS)3,4d后将其收集并机械吹打成单细胞悬液,重悬于SFM,按1:4的比例传代于6孔板。U-251接种于传统SSM中，连续传代观察作为对照。1.2.3有限稀释、单克隆形成实验将贴壁生长于SSM中的U-251细胞经胰酶消化，吹打成单细胞悬液，以每孔100μl无血清培养基中含10个细胞的浓度接种于96孔板，以后每日每孔添加20μl新鲜无血清培养基,
