p38mapk基因诱导胶质瘤细胞凋亡论文

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1、p38MAPK基因诱导胶质瘤细胞凋亡论文.freela;apoptosis;ratsAbstract:AIMTostudytheeffectofp38MAPKtransfec-tiononthebiologicalcharacteristicsofgliomacellC6.METHODSp38MAPKacellC6bylipofectin.Expressionofp38MAPKmunocytochemistry.HEstainingandfloetryeasurethecellmorphology，adhesionandcellcycle.RESULTSp38M

2、APKacells，erging.CONCLUSIONApoptosisofgliomacellcouldbeinducedbyp38MAPKtransfection.0引言蛋白质的磷酸化与去磷酸化是传递细胞各种信息的重要转导机制.蛋白激酶催化磷酸基团与蛋白质内特异的氨基酸共价结合.一系列的蛋白激酶及其磷酸化活化构成了信号转导级联反应.丝裂素活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase.freelinalkinase，JNK）/应激活化蛋白激酶（stress-activatedproteinkinase，SAPK）通路，ERK5/大

3、丝裂素活化蛋白激酶1（bigMAPkinase，BMK1）通路和p38MAPK通路.它们参与了细胞生长、发育、分裂及细胞间的功能同步等多种生理过程，并参与细胞的恶性转化等病理过程.p38MAPK除在细胞应激、炎症反应中具有重要作用外，也与细胞的发育、分化和凋亡密切相关.胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，p38MAPK对其生长的调节作用尚不了解.我们将外源性p38MAPK基因转染大鼠胶质瘤细胞系C6，以期研究其对胶质瘤细胞生物学特性的影响，为充实信号转导在胶质瘤中的作用提供理论依据.1材料和方法1.1材料大鼠胶质瘤细胞系C6由本教研室保存.pCMV5-p38MAP

4、K质粒和兔抗鼠p38MAPK抗体由新加坡国立大学林圣彩教授惠赠.pCMV5质粒由本校生化教研室孙强惠赠.脂质体购自Gibco公司.免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司.1.2基因转染大鼠胶质瘤细胞系C6在含150mLL-1小牛血清的RPMI1640培养液中常规培养，细胞生长至对数期时以2×105/孔接种于6孔板，培养24h.将2μgpCMV5-p38MAPK，10μL脂质体分别溶于100μL无血清培养基，两溶液缓慢混匀，室温放置30min，加入0.8mL无血清培养基，混匀后加入上述培养细胞内，常规培养4h后，加入1mL含150mLL-1小牛血清的培养液，继续培养24

5、h.同法转染pCMV5质粒及未转染C6细胞作为对照.1.3形态学检测转染同时制备细胞爬片，转染后30h取出，PBS洗涤2次，950mLL-1乙醇固定15min，HE染色.1.4免疫细胞化学染色细胞爬片处理同上.一抗为兔抗鼠p38MAPK抗体（1∶50），4℃过夜，加入二抗，室温30min，加入SABC复合物，DAB显色，苏木素衬染.1.5细胞周期分析3组细胞各约1×106个，经胰酶消化成单细胞悬液，PBS洗涤2次，700mLL-1冷乙醇固定过夜，用DPAI进行染色，于流式细胞仪进行细胞周期分析.2结果2.1形态学检测转染pCMV5-p38MAPK质粒后，细胞由原

6、来的多突起形逐渐变为双极或圆形，体积缩小，细胞内空泡增多（Fig1），贴壁性降低，36h后可见部分细胞漂浮于培养液中.pCMV5质粒组和空白对照组无明显变化.HE染色显示pCMV5质粒组和空白对照组细胞形态一致，可见大量核分裂象，转染pCMV5-p38MAPK质粒组核分裂象明显减少，细胞形态改变，密度减低，部分细胞固缩变圆，深染，胞核染色质边集，呈环状、碎块状或新月体状，可见胞质“出泡”现象，此即凋亡细胞（Fig2）.2.2免疫细胞化学染色转染pCMV5-p38MAPK质粒组P38MAPK蛋白表达阳性，主要定位于胞质或（和）胞核，凋亡细胞阳性稍强，部分凋亡细胞胞

7、核也可见阳性表达（Fig3）.pCMV5质粒组和空白对照组均未见p38MAPK蛋白表达.证实转染pCMV5-p38MAPK质粒组有外源性p38MAPK基因的表达，而pCMV5质粒组和空白对照组则无外源性p38MAPK基因.2.3细胞周期分析转染pCMV5-p38MAPK质粒组、pCMV5质粒组和空白对照组G1/G2无明显变化，但转染pCMV5-p38MAPK质粒组出现明显凋亡峰，凋亡细胞占总数的34.1%（Fig4）.图1－图3略3讨论p38MAPK通路是1993年发现的一类MAPK通路.研究表明，细菌脂多糖（LPS）、紫杉醇（taxol）和蛋白激酶C（PKC）

8、的特异激活剂PMA可以快