apoptin基因诱导a375细胞凋亡信号转导机

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1、Apoptin基因诱导A375细胞凋亡信号转导机【关键词】肿瘤特异性凋亡基因；细胞；凋亡；半胱天冬蛋白酶,　　摘要：目的研究肿瘤特异性凋亡基因(apoptin)在诱导人黑色素瘤细胞A375凋亡中的信号转导机制。方法用含有apoptin基因的真核表达载体瞬间转染体外培养的人黑色素瘤细胞A375；采用RT-PCR、DNA凝胶电泳、流式细胞仪分析检测A375的细胞的凋亡；以比色法检测半胱天冬蛋白酶8(caspase-8)和caspase-3的相对活性。结果Apoptin基因瞬间传染的A375细胞可出现典型的细胞凋亡所具有DNA梯状带；流式细胞术发现实验组细胞凋亡率明显高于其他各组(P<00

2、1)；Caspase-3的活性升高，但caspase-8活性没有明显变化。结论Apoptin基因可通过激活caspase-3诱导人黑色素瘤细胞A375凋亡。　　关键词：肿瘤特异性凋亡基因；细胞；凋亡；半胱天冬蛋白酶　　StudyonsignaltransductioninapoptosisofhumanmelanomacellsA375inducedbyapoptin　　LabofMolecularBiology,CenterforDiseaseControlandPrevention,ShenyangMilitarymand(Shenyang110034,China)Abstract：O

3、bjectiveTostudyanmelanomacellsA375viatheactivationcaspase-8andcaspase-3.MethodsThehumanmelanomacellsA375id,easuredbyDNAagaroseelectrophoresis,RT-PCRandfloetry.Caspase-8andcaspase-3relativeactivityetricassayatvarioustime.ResultsTheapoptingenecouldinduceapoptosisofhumanmelanomacellsA375invitroandthe

4、mRNAofapoptingenecouldbedetectedbyRT-PCR.Theactivityofcaspase-3begantoriseinA375cellsaftertransfectedanmelanomacellsA375viaactivecaspase-3.　　Keyina、凋亡细胞DNA提取试剂盒(美国Invitogen公司)；溴化丙啶(PI)和RT-PCR试剂盒(美国Sigma公司)；caspase-8检测试剂盒(美国Calbiochem-Novabiochem公司)和caspase-3底物AC-DEVD-pNA(英国Alexls公司)；流式细胞仪(美国Coulte

5、r公司)；550型酶标免疫测定仪(瑞典Bio-Rad公司)。其他化学试剂均为国产分析纯。质粒pcDNAA3由本室构建，内含肿瘤特异性凋亡基因，采用硷变性法大量提取质粒DNA，用PEG沉淀法进行纯化，所得质粒DNA含量为2g/L，纯度达到电泳纯〔5〕。人黑色素瘤细胞A375引自军事医学科学院。　　12方法　　121细胞瞬间转染参照Lipofectamin转染说明书进行。转染前24h，将A375细胞重铺在T25培养瓶中，待细胞长至底面积80%时，进行转染。将10μlDNA和20μlLipofectamin各加入500μl无血清(DMEM)中，轻轻震荡5min，将二者混合即成转染液。室温静置20

6、min，用无血清DMEM洗细胞2次，加入5ml无血清的DMEM，逐滴加入转染液，边加边轻轻混合，置37℃孵育8h。弃去转染液，换含100ml/L新生牛血清的DMEM培养液，继续培养。分别于转染后的不同时间，观察并取转染细胞进行鉴定，用等量的pcDNA31空质粒作转染对照。　　122RT-PCR鉴定取1×106个转染不同时间的A375细胞，按异硫氰酸胍一步法，提取总RNA，作为RT-PCR的模板，用RT-PCR扩增ApoptincDNA〔6〕。　　123凋亡细胞DNA鉴定DNA凝胶电泳，取1×106个A375细胞，加入500μl细胞裂解液(10mmol/LTris-HCLpH74、10mmo

7、l/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、150mmol/LNaCl、5g/L十二烷基硫酸钠(SDS)及400mg/L蛋白酶K)，于50℃作用3h，不时振摇。加入等体积的平衡酚、氯仿-异戊醇抽提后，以2500r/min离心10min，加25倍无水乙醇沉淀。用700ml/L乙醇沉淀、干燥后，将DNA溶入40μlTE液中，加入20μl的10g/LRnase，37℃水浴30min。取30μlDNA，进行15g/L琼脂糖凝胶电泳，细胞