绵羊痘病毒gy株的分离鉴定及靶向其rna聚合酶基因sirna的筛选

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1、密级：论文编号:中囯农业利^学院学位论文绵羊痘病毒GY株的分离鉴定及靶向其RNA聚合酶基因siRNA的筛选IsolationandIdentificationofSheeppoxVirusGuyuanStrainandScreeningofsiRNATargetingitsRNApolymerasegene硕士研宄生：王曼指导教师：张强研宄员申请学位类别：兽医硕士专业：兽医培养单位：兰州兽医研究所研宄生院2»15年5月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertatio

2、nIsolationandIdentificationofSheeppoxVirusGuyuanStrainandScreeningofsiRNATargetingitsRNApolymerasegeneM.S.Candidate：WangManSupervisor：ProfessorZhangQiangDegree：MasterofVeterinarianSpecialty:VeterinarianMay2015I独创性声明II摘要绵羊痘病毒（Sheeppoxvirus，SPPV）、山羊痘病毒（Goatpoxvirus，GTPV）

3、和疙瘩皮肤病病毒（Lumpyskindiseasevirus，LSDV）为痘病毒科（Poxviridae），脊椎动物痘病毒亚科（Chordopoxvirinae），羊痘病毒属（Capripoxvirus，CaPV）成员，可分别感染绵羊、山羊和牛，引起绵羊痘、山羊痘和牛结节性疹块病。近年来，绵羊痘在我国多地发生，大量绵羊患病死亡，给养殖业带来极大的经济损失。SPPV的基因组在侵入宿主细胞前由衣壳保护，衣壳在病毒侵入宿主细胞后，在适当的时间和位置被内在的环境所解离，使病毒基因组快速释放到细胞质中进行复制。因此，SPPV能否在细胞中增殖的

4、一个决定因素就是病毒能不能脱去衣壳。脱壳过程依赖于RNA和蛋白质的合成。目前，引起绵羊痘病毒脱壳的脱壳蛋白的结构和功能及其编码基因，以及转录脱壳蛋白的RNA聚合酶亚基尚不知晓。本研究在成功分离鉴定一株绵羊痘病毒的基础上，初步进行了绵羊痘病毒RNA聚合酶基因的干扰的研究，为探究RNA聚合酶与脱壳的相关性奠定了基础。取发病绵羊的皮肤痘疹研磨制成病料样品悬液，将该悬液感染未免疫绵羊，同时接种原代羔羊睾丸（LT）细胞，盲传5代后，转接Vero细胞，进行间接免疫荧光和PCR鉴定。样品悬液感染未免疫绵羊后出现羊痘典型发病症状，经过LT细胞传代后

5、转接Vero细胞，出现了特征性细胞病变，免疫荧光和PCR均检测出病毒存在。PCR产物核酸序列测定结果显示，分离毒株的基因片段与已发表的绵羊痘病毒毒株的相应基因片段同源性在99%以上。上述结果表明，本研究从宁夏固原疑似羊痘病毒感染的绵羊中成功分离到1株SPPV，命名为SPPVGY株。以GY株基因组为模板，通过PCR扩增获得ORF051和ORF065基因，并对其生物学进行分析，确定了其稳定性和保守性，为设计靶向siRNA提供理论基础。采用设计软件siDirectversion2.0进行siRNA的设计和初步评估，尽可能的规避脱靶效应，为

6、两条目的基因分别最终确定选用3个siRNA作为进一步实验验证的靶标分子。构建表达目的基因的重组pEGFP-N1载体，转染BHK细胞确定48h荧光表达量最高；siRNA分别与靶向目的基因的重组pEGFP-N1载体共转染，确定6条siRNA均有抑制作用，且其中靶向SPPVORF051基因的siRNA2与靶向SPPVORF065基因的siRNA3效果最好。以GY株病毒接种至Vero细胞，间隔8h收取培养液和细胞，以此建立了病毒一步生长曲线。由一步生长曲线确定最佳收毒时间为88h。将目的基因重组于plv-puro载体，通过嘌呤霉素加压筛选建

7、立了SPPV-ORF051和SPPV-ORF065稳定表达的Vero细胞系。本研究采用生物信息学系统分析羊痘病毒的RNA聚合酶基因SPPV-ORF051和SPPV-ORF065，确定了其作为siRNA靶向抑制分子的可行性。病毒一步生长曲线的建立有助于了解病毒在宿主细胞内感染的动力学，同时为本研究中的RNA干扰试验提供工具。构建稳定表达两个RNA聚合酶的Vero细胞系，为探究过表达的RNA聚合酶对于病毒脱壳的影响。以GPF为报告基因，获得了最佳抑制效果的siRNA，为进一步研究RNA聚合酶与脱壳的关系奠定了基础。关键词：SPPV，GY

8、株，一步生长曲线，细胞系，siRNAIAbstractCapripoxvirusisagenusofvirusesinthesubfamilyChordopoxvirinaeandthefamilyPoxviridae,consist