绵羊痘病毒gy株的分离鉴定及靶向其rna聚合酶基因sirna的筛选-兽医专业毕业论文

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1、No．Secrecy：ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationIsolationandIdentificationofSheeppoxVirusGuyuanStrainandScreeningofsiRNATargetingitsRNApolymerasegene^-一M．S．Candidate：WangManSupervisor：ProfessorZhangQiangDegree：MasterofVeterinarianSpecialty：VeterinarianMay2015万方数据独创性声明本人声明所呈交

2、的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一周工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：要曼时间：如{r年芗月哆日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方

3、式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：王曼时间：潮嗲年乡月l多昂导师签名：弓亏豹lhJ：妇l岁年乡月l弓R万方数据中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表绵羊瘾病毒GY株的分离鉴定及靶向其RNA聚合酶基因siRNA的筛论文题目涟瘸原微生物及论文作者王曼专业预防兽医研究方向其分子生物学指导教师张强研究员培养单位(研究所)兰州兽医研究所硕(褥)姓名职称单位专业签名导师评硕导口＼＼＼趸缛博导口人裔湃＼＼阅硕导口辩导口答辩硕导口甘肃农业大学动物医主胡永浩教授礴导矿学院预防兽医学稍最赡痛孙晓林教授硕导留1lj-’肃农业大学动物医预防兽医学五跚

4、博学口学院陈轶霞教授学与工程学院预防兽医学砟糯硕导百西北民族大学生命科躲博导口答硕导口中圜农业科学院兰州张志东研究员蹲导吝兽医研究所预防落医学辩副研究硕导西中圈农业科学院兰州窦永喜贝博导口兽医研究所预防兽医学／爹渡委硕导口员博导口硕导口博导口硕导口媾导瞪会议记蒙(秘书)朱学亮论文答辩时间地点2015年5月13同予兰髑落医研究所综台楼三三楼会没室万方数据摘要绵羊痘病毒(Sheeppoxvirus，SPPV)、山羊痘病毒(Goatpoxvirus，GTPV)和疙瘩皮肤病病毒(Lumpyskindiseasevirus，LSDV)为痘病毒科(Poxviridae)，脊椎动

5、物痘病毒亚科(Chordopoxvirinae)，羊痘病毒属(Capfipoxvirus，CaPV)成员，可分别感染绵羊、山羊和牛，引起绵羊痘、山羊痘和牛结节性疹块病。近年来，绵羊痘在我国多地发生，大量绵羊患病死亡，给养殖业带来极大的经济损失。SPPV的基因组在侵入宿主细胞前由衣壳保护，衣壳在病毒侵入宿主细胞后，在适当的时间和位置被内在的环境所解离，使病毒基因组快速释放到细胞质中进行复制。因此，SPPV能否在细胞中增殖的一个决定因素就是病毒能不能脱去衣壳。脱壳过程依赖予RNA和蛋白质的合成。目前，引起绵羊痘病毒脱壳的脱壳蛋白的结构和功能及其编码基因，以及转录脱壳蛋白

6、的RNA聚合酶亚基尚不知晓。本研究在成功分离鉴定一株绵羊痘病毒的基础上，初步进行了绵羊痘病毒RNA聚合酶基因的干扰的研究，为探究RNA聚合酶与脱壳的相关性奠定了基础。取发病绵羊的皮肤痘疹研磨制成病料样品悬液，将该悬液感染未免疫绵羊，同时接种原代羔羊睾丸(LT)细胞，盲传5代后，转接Veto细胞，进行间接免疫荧光和PCR鉴定。样品悬液感染未免疫绵羊后出现羊痘典型发病症状，经过LT细胞传代后转接Vero细胞，出现了特征性细胞病变，免疫荧光和PCR均检测出病毒存在。PCR产物核酸序列测定结果显示，分离毒株的基因片段与已发表的绵羊痘病毒毒株的相应基因片段同源性在99％以上。

7、上述结果表明，本研究从宁夏固原疑似羊痘病毒感染的绵羊中成功分离到1株SPPV·，命名为SPPVGY株。以GY株基因组为模板，通过PCR扩增获得ORF051和ORF065基因，并对其生物学进行分析，确定了其稳定性和保守性，为设计靶向siRNA提供理论基础。采用设计软件siDirectversion2．0进行siRNA的设计和初步评估，尽可能的规避脱靶效应，为两条目的基因分别最终确定选用3个siRNA作为进一步实验验证的靶标分子。构建表达目的基因的重组pEGFP．N1载体，转染BHK细胞确定48h荧光表达量最高；siRNA分别与靶向目的基因的重组pEGFP-N1载体