罗汉果葡萄糖基转移酶基因的克隆及原核表达

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1、分类号墅2壹学校代码!Q量塑学号密级公珏傣两夫法学位论文罗汉果葡萄糖基转移酶基因的克隆及原核表达专业名称作物遗传育种学院名称查堂堕指导教师---Sd,呈F研究员、韦鹏霄副研究员申请学位级别硕士论文提交日期2Q!墨生墨旦论文答辩日期2013年5月22日学位授予日期2013午明答辩委员会主席周瑞阳教授论文评阅人广西大学学位论文原创性和使用授权声明]嘲螋本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果

2、，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料。与我一同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于：口保密，在年解密后适用授权。囹不保密

3、。(请在以上相应方框内打“√”)论文作者签名：指导教师签名：作者联系电话：心97’77／6『)2，艄硼咿物一，广驯柳阮稼电罗汉果葡萄糖基转移酶基因的克隆及原核表达摘要罗汉果(Siraitiagrosvenorii)是仅分布于广西北部山区的中国特有的药用和甜料植物，其有效成分甜苷V(MogrosidesV)是世界上最强的非糖甜味物质之一，亦具有很好的药理药效，应用前景十分广阔。但甜苷V含量低、生产成本高的问题严重制约着产业的发展。据调查，甜苷V的含量每增加0．1％，其提取成本可降低10％。因此，提高甜苷

4、V含量的研究已成为热门的研究方向。采用传统的改进栽培措施或杂交育种等法来提高甜苷V含量难度大、周期长，且提高有限。从分子水平阐明甜苷V生物合成途径，找到控制甜苷V合成的关键酶基因，利用基因工程技术对罗汉果进行分子育种，是提高甜苷V含量快速而有效的新途径。葡萄糖基转移酶(UDP．glucoyltranferae，UDPG)作为甜苷V生物合成中最后一步关键酶而成为研究重点。通过罗汉果转录组、表达谱及含量的关联分析，获得两条与甜苷V生物合成相关的葡萄糖基转移酶(UDPG)的unigene片段，以罗汉果授粉后

5、70d的果实RNA为模板，利用RACE和RT-PCR技术克隆UDPG全长基因，将克隆得到的SgUDPGl基因和SgUDPG2基因连接到原核表达载体pEASYTM—E1上，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，通过IPTG诱导表达，重组蛋白纯化，SDS—PAGE检测表达产物以及Western-blotting和质谱鉴定蛋白产物。结果表明，获得了1条SgUDPGl，全长为1959bp，开放阅读框ORF为1365bp，编码一条454aa的肽链，理论分子量为51．2kD，等电点为5．39，具有植物中次生代谢

6、产物糖基转移酶特有的保守结构域PSPG．boxmotif。SgUDPGl在授粉后50d和70d的果实中表达逐渐升高，是对照授粉后3d的5．16倍和13．12倍，与果实中甜苷v含量呈相同趋势。经探究SgUDPGl原核表达最优条件的实验，获得SgUDPGl表达的最佳IPTG的浓度为O．1mmol·L-1，表达的最佳时间为3h，表达的最佳温度为17。C，此基因的ORF可以在大肠杆菌中表达，并且可以纯化出比理论分子量大5．3kD的融合蛋白，通过Western-blotting和质谱鉴定，确定该蛋白属于罗汉果葡

7、萄糖基转移酶。同时获得1条SgUDPG2，全长为I722bp，开放阅读框ORF为1440bp，编码一l条479aa的肽链，理论分子量为52．3kD，等电点为5．10，也具有次生代谢产物糖基转移酶特有的保守结构域PSPG—boxmotifoSgUDPG2在授粉后50d和70d的果实中表达逐渐升高，是对照授粉后3d的1．52倍和10．3l倍。SgUDPG2原核表达的最佳IPTG浓度为0．1mmol·L～，表达的最佳时间为12h，表达的最佳温度为17。C，此基因的ORF可以在大肠杆菌中表达，并且可以纯化出比

8、理论分子量大5．6kD的融合蛋白，通过Western-blotting鉴定，初步确定为罗汉果葡萄糖基转移酶。本论文对2个与罗汉果甜苷V生物合成密切相关的葡萄糖基转移酶基因进行了RACE克隆，并进行了原核表达研究，纯化出融合蛋白，并通过Western-blotting或质谱技术鉴定为罗汉果葡萄糖基转移酶。罗汉果SgUDPGI和SgUDPG2的克隆和原核表达的成功，为下一步研究其功能奠定了实验基础，为罗汉果功能基因组学以及甜苷V生物合成分子机理研究提供了科学