柴苓汤对慢性环孢素a肾病大鼠肾脏炎性介质影响

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中丈摘要柴苓汤对慢性环孢素A肾病大鼠肾脏炎性介质的影响摘要目的：本研究通过观察柴苓汤对慢性环孢素A肾病大鼠肾脏炎性介质的影响，探讨柴苓汤对CsA慢性肾毒性的保护作用及其机制，为该方在临床应用提供实验依据。方法：本试验研究选用健康、清洁级、雌性SD大鼠40只，体重约2009，适应性饲养一周后，随机分为4组：对照组(A组Controlgroup)、模型组(B组CsAgroup)、缬沙坦组(C组Valsartangroup)、中药组(D组Chailinggroup)，每组各10只。模型组给予CsA30mg·kg-1．d。灌胃，对照组给予等容量橄榄油；此外，缬沙坦组予缬沙坦10mg·kg"l-d一(阿拉伯胶制为混悬液)，中药组予柴苓汤39·kg-t．d一，经水溶解后灌胃给药。每周末分别置代谢笼中取尿。第28天，断头取血，迅速离心，留取血清、血浆标本，．4。C保存，待用于血肌酐(Scr)、尿素氮(ram)的检测，并计算肌酐清除率(Ccr)；迅速切取小块’肾脏组织固定，用于观察肾脏病理改变；免疫组化采用ABC法检测单核细胞趋化蛋白一I(MCP．I)、肿瘤坏死因子一ct(TNF—a)；RT-PCR测定组织中MCP—ImRNA、TNF-ⅨmRNA的表达。结果：1柴苓汤对CsA慢性肾毒性大鼠肾功能的影响环孢素组大鼠尿素氮(BUN)、血肌酐(Sc0较对照组明显升高(尸O．05)。7炎性细胞介质与纤维化相关性分析将两组大鼠肾组织MCP一1、TNF．0【表达水平分别与相应的纤维化指标进行相关性分析，结果显示，MCP—I、TNF．c【表达水平与。肾小管间质纤维化评分，均存在正相关，相关系数分别为0．755，0．812，P均75％)。 研究论文2．4．2．2肾间质炎性细胞计数：每张切片随机选取10个高倍视野(×400，HPF)，计数肾间质中浸润的炎性细胞数(包括单核巨噬细胞，淋巴细胞，中性粒细胞)，结果以炎性细胞数／HPF表示，以其均值作为该标本的最后结果。2．4．3肾功能测定：血清尿素氮采用二乙酰．肟法测定，血清肌酐(SCr)ffI]尿肌酐(Ucr)采用苦味酸法测定，按试剂盒要求进行检测。肌酐清除率计算公式：肌酐清除率=尿肌酐x24h尿量／血肌酐／1440。2．4．4单核细胞趋化蛋白．I(MCP．1)、肿瘤坏死因子．a(TNF．0L)采用免疫组织化学测定：ABC法具体步骤为：取新鲜肾组织，4％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，切片厚度为39m，脱蜡下行至蒸馏水；PBS浸洗5min，用滤纸将组织周围的水分吸干；3％过氧化氢室温下孵育，20min；PBS清洗3次，每次5min；枸橼酸缓冲液(pH6．O)微波炉内修复，98℃维持10min；冷却至室温；PBS清洗3次，每次5min；滴加非免疫性血清封闭，室温孵育，30min，倾去液体，注意勿洗；加入一抗，4℃过夜；PBS清洗3次，每次5min；滴加生物素标记的二抗，室温60min；PBS清洗3次，每次5min；滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素，37℃孵育30min；PBS清洗3次，每次5min；DAB显色lmin，光镜下控制细胞显色程度，5-20min：自来水充分冲洗，终止显色；苏木素复染细胞核；常规酒精逐级脱水，二甲苯透明，树胶封片。以镜下出现棕黄色颗粒为阳性表达。以PBS替代二抗作为阴性对照。免疫组织化学染色半定量分析：采用HPIAS一1000型全自动彩色病理图像分析系统，在200倍光镜下测量每个显示屏的阳性染色面积和染色程度(积分光密度)，4组大鼠每组选取3只大鼠标本，每个标本测量10个视野进行半定量分析(每个显示屏的面积一样)。2．4．5单核细胞趋化蛋白．I(MCP一1)mRNA、肿瘤坏死因子．a(TNF．0t)mRNA的表达：采用RT-PCR测定。2．4．5．1总RNA的提取取组织100ug左右，放入匀浆器中，加入lml的Trizol，用匀浆器匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状，然后转入新的离心管中，室温静置5分钟，4。C12000rpm离心5分钟，小心吸取上清液于另一离心管，加入1／5体积的氯仿，震荡混匀后室温竞逐5分钟，4。C12000rpm离心15分钟。转 研究论文移上层水相到另一离心管中，加入等体积的异丙醇，然后充分混匀后室温静置1O分钟，然后4℃12000rpm离心10分钟，RNA形成白色的小团沉淀在离心管的底部和侧面，弃上清，加入75％的乙醇lml，4。C12000rpm离心5分钟，尽量弃上清，漂洗2．3次RNA沉淀。最后，在无菌台中干燥RNA沉淀5．10分钟，加入DEPC处理的蒸馏水50ul，55．60℃温育10分钟使RNA充分溶解，取少许溶解的RNA，用TEBuffer稀释于紫外分光光度计260和280nm处读取A值，A260／A280=1．8．2．0间方可使用，总RNA浓度=A260x稀释倍数x0．04(ug／u1)，用前调整为lug／ul。2．4．5．2逆转录反应取总RNA2ug，加入RT反应体系(含AMVBuffer，dNIPs，Oligo’dTPrimer，AMV，RnaseInhibitor等、)管中，并用DEPC水处理，补足到50ul反应液体积，震荡混匀后短暂离心，置于PCR仪中42。C30分钟(cDNA合成)，99。C5分钟(逆转录酶失活)，5。C5分钟，．20。C保存备用。2．4．5．3PCR反应2．4．5．3．1PCR扩增引物TNF—alpha上游引物5’．TACACTGGCCCGAGGCAACA一3’下游引物5’．GGGCAAGGGCTCTTGATGGC一3’扩增片段为582bpMCP．1上游引物5'-ACAGACAGAGGCCAGCCCAG．3’下游引物5'-TCTCCAGCCGACTCATTGGGA．3’扩增片段为215bp18S上游引物5’．CACGGTGTCACCCAGACCCG．3’下游引物5’．AGCAGAGGCAGTGGCAGACT-3’扩增片段为273bp2．4．5．3．2PCR反应体系：反应体系中含TaqDNA聚合酶，dNIPs，稳定剂，反应缓冲液，逆转录反应产物，上下游引物等。震荡混匀后短暂离心，加入PCR仪中。2．4．5．3．3PCR反应条件：PCR扩增条件：94。C变性3分钟(94。C40s，各自 研究论文的退火温度30s，52。C60s)30个循环；72。C延伸10分钟。2．4．5．4半定量分析取每个标本的扩增产物15ul于1％的含GV核酸染料的琼脂糖凝胶电泳，以DNAMarkerDL2000作为标准分子量标记，电泳后于紫外投射仪观察，并用数码照相机照相，输入微机应用法国VL公司BIO—PROFIF凝胶图像分析系统对目的电泳条进行分析，以相应的内参电泳条带作为参照，结果以两者之积分吸光度的比值表示。2．5统计学处理使用SPSSl3．0forwindows统计软件分析数据资料。各组数据比较前先进行正态性及方差齐性检验，满足正态性及方差齐性者，采用单因素方差分析，多组比较采用单因素方差分析(One．wayANOVA)，组间比较采用LSD检验；不满足者采用秩和检验。数值变量以均数加减标准差(i姆．)表示，各项指标间相关关系采用Spearman等级相关系数表示。所有假设检验方法均以O．05为显著性水准。结果1．实验动物一般情况对照组大鼠一般情况良好，精神、饮食、尿量等未见明显异常。环孢素组精神萎靡、毛发枯黄，饮食明显减少，一般状况差。缬沙坦组及中药组精神、饮食等明显改善。2柴苓汤对CSA慢性肾毒性大鼠肾功能的影响：结果见(TablelFig．1、2、3、4)环孢素组大鼠尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)较对照组明显升高伊O．05)。5．炎性细胞介质与纤维化相关性分析将两组大鼠肾组织MCP．1、TNF．仅表达水平分别与相应的纤维化指标进行相关性分析，结果显示MCP．1、TNF．0【表达水平与肾小管间质纤维化评分，均存在正相关，相关系数分别为0．755，0．812，P均