柴苓汤对环孢素a慢性肾毒性大鼠ras系统的作用

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目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·l英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·4研究论文柴苓汤对环孢素A慢性肾毒性大鼠RAS系统的用前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．9fjU舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯’7材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··9结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．14附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．16附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．24讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．26结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．34参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·35综述环孢素致慢性。肾毒性以及防治的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯38致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯50个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5l 中文摘要柴苓汤对环孢素A慢性肾毒性大鼠RAS系统的作用摘要目的：观察环孢素A(cyclosporineA，CsA)慢性肾毒性大鼠肾素活性(PRA)、血管紧张素II(AngII)水平、血管紧张素转化酶(ACE)表达，肾脏中血管紧张素I(AngI)mRNA、血管紧张素II(AngII)mRNA以及盐皮质激素受体(MR)mRNA表达，研究柴苓汤对CsA慢性肾毒性的防治作用及机制。CsA是目前应用于器官移植抗排斥反应及多种自身免疫性疾病的治疗药物，其最主要的副作用为肾毒性，包括急性和慢性肾毒性。CsA急性肾毒性呈剂量相关性，是由于肾脏入球小动脉的收缩引起肾小球滤过率(GFR)下降以及肾功能急性恶化，无持久的病理改变，是可逆的。当CsA剂量减低或停用后，肾脏血流动力学紊乱可得以纠正，肾功能也可恢复正常。相反，CsA慢性肾毒性常伴有不可逆的结构改变，其临床特征为进行性肾功能减退、肾脏小动脉壁特别是入球小动脉壁特征性玻璃样变性、肾小管萎缩及不可逆的间质纤维化，影响病人的长期存活，虽采用多种药物治疗，但目前尚缺乏满意的疗效。慢性CsA肾病属于中医“水肿"、“腰痛”、“虚劳”、“关格”等范畴。药毒伤肾，肝郁气滞，脾肾亏虚，水湿内停是本病的主要病机特点。治疗上应利水解毒、补益脾肾、疏肝理气。柴苓汤由《伤寒杂病论》中的“小柴胡汤”和“五苓散”组合而成。该方首见于汉代《世医得效方》，经元代《丹溪心法》而传承于世。柴苓汤由“柴胡、黄芩、半夏、人参、甘草、生姜、大枣、泽泻、猪苓、茯苓、白术、桂枝"等药物组成，具有利水泻毒、疏肝健脾的功效，与CsA肾病的机制相近，故用此观察对慢性肾损伤后肾素．血管紧张素．醛固酮系统(RAS)的作用，为今后的临床应用提供实验依据。本实验采用SD(Sprague—Dawley)雌性大鼠，普通饮食，CsA30mg．kg～．d-l灌胃4周建立CsA慢性肾毒性大鼠模型，给予柴苓汤、缬沙坦灌服，观察了尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、肌酐清除率(Ccr)、肾素活性(PRA)、血管紧张素II(AnglI)以及肾脏中血管紧张素转化酶(ACE)、血管紧张素 中文摘要I(AngI)mRNA、血管紧张素II(AngII)mRNA以及盐皮质激素受体(MR)mRNA表达，研究肾素．血管紧张素．醛固酮(RAS)系统与CsA慢性。肾毒性的关系，进一步探讨柴苓汤对CsA慢性肾毒性的预防作用及作用机制，从而为该方的临床应用提供科学的实验依据。方法：选用健康清洁级雌性SD大鼠40只，体重200士109，适应性喂养一周后，逐一称重按重量标号，按照随即分配的原则分为4组：对照组(Contr01group)、模型组(CsAgroup)、缬沙坦组(Valsartangroup)、柴苓汤组(TCMgroup)，每组10只。造模动物给予CsA30mg·kg～·d。1经口灌服，对照组则给予等容量橄榄油。此外，缬沙坦组予缬沙坦10mg·kg～·d～，柴苓汤组予柴苓汤39·kg～·d～，蒸馏水溶解后经口灌胃，共28天。每周末将动物放入代谢笼中，收集24小时尿液，并测体重(bodywei曲t，BW)。末次给药后，禁食12小时，断头取血，用于血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)的检测，并计算肌酐清除率(Ccr)；取左侧肾脏组织，4％多聚甲醛液固定，脱水，石蜡包埋切片，以3“m的石蜡切片，行HE、Masson染色，用于观察肾脏病理改变；放射免疫法检测PRA、AngII；免疫组化检测血管紧张素转换酶(ACE)的表达；ImPCR测定肾脏血管紧张素I(AngI)mRNA、血管紧张素II(AngII)mRNA以及盐皮质激素受体(MR)mRNA表达。结果：①生化指标：与对照组比较，模型组大鼠血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)显著上升，肌酐清除率(Ccr)降低(PO．05)，柴苓汤组组大鼠AngIImRNA表达降低有显著性差异(PO．05)。结论：1采用CsA灌胃诱导肾间质损伤，导致大鼠尿素氮、血肌酐升高，肌酐清除率降低；肾脏组织病理显示肾小管间质胶原成分显著增多和炎性细胞浸润等肾损害表现。2柴苓汤可以降低尿素氮、血肌酐，提高肌酐清除率，减轻肾功能损伤。3柴苓汤能够降低血清及组织中PRA、AngII的水平，下调ACE的表达，通过阻断RAS系统，起到改善肾小球滤过率和肾功能保护作用，从而延缓慢性肾毒性的进展。4柴苓汤可下调肾脏AngImRNA、AngIImIⅢA的表达。关键词：柴苓汤；环孢素；慢性肾毒性大鼠；肾脏损伤；肾素活性；血管紧张素I；血管紧张素II；盐皮质激素受体 英文摘要TheEffectofChaiLingTangonI认SsysteminChronicCyclosporineANephrotoxici锣RatsABSTRACTObjective：Toobservereninactivity(PRA)，angiotensinII(AngII)，a．n￡iotensin．convertionenzⅥne(ACE’)．RenalangiotensinI(AngI)mRNA，an910tensm-COnvenlOnenz”nelA乙EJ，KenalanglOtensmlLAng上JmK州A，angiotensinII(AngII)mRNAandmineraloco卜ticoidrec印tor(MR)mRNAinratswithcyclosporineA．ExporethemechanismofChaiLingTangonchronicCsAtoxicity．CsAwhichusedino玛antransplantationiscurrentlythemainim珈lunosuppressant，becauseofitstoxicitysuchasrenaltoxicitywhichis1imitedusingclinicalapplication．T11erearet、)~rotypesofrenaltoxicitybyCsA．0neisacutenephrotoxicity，andtheotherischronicn印hrotoxicity．Acuten印hrotoxicityisrelativetodmgswhichinducedrenalaf．ferentaneqcontractionanditoRenhasn’tlastingpathologicchanges．WhenCsAisreducedordisableddisorderofrenalhemodynamicsisimproVed，renal如nctionremmtononnal．MechanismofchronicCsAnephrotoxicityisstillunclearnow．ThecharacterofCsAinclinicisshowedwithprogressiVerenaldys如nction，irreversibleinterstitialfmrosis，tubularatrophyandafferentarterieshyaline．Ita￡fectslong·temsuⅣiValofpatients，anditiscurrentlylackofsatisfactorytreatment．ChroniccyclosporineAnephropathyissimilartosomediseasesintraditonalchinesemedcine，suchasEdema，Lumbago，Dysu打aandothers．Itisresulted肋mdmgtoxin，spleenandl(idneydeficiency．Inducingdiuresisforremovingedemaandreducingtoxicityareappropriatetreatments，andappropriateprescriptionisChaiLing1f叠mg．ChaiLing’I’angisonginatedfbm砌口，z办口咒历6打喀上“刀a11dconlposedofXiaoChaiHuTangandWhLingSan．TheprescriptionfirstappearedintheHanDynastyof册fM眈池D凡馏，andthenh嘶tagedtotheworldbymeansoftheYuanDynastyofD口玎m粥甩月口．ChaiLingTangiscomposedofBupleumm，Pinellia，Scutellaria，jujube，^ 英文摘要ginseng，liconce，ginger，A1isma，Atractylodes，Polyporus，PoriaandCinnamonTWig．ItplaysanimportantroleinhannonzingliVerandkidney：AnditsmechanismissimilartocyclosporineAnephropathy．Asaresult，weobservedtheef．fectofrenin—angiotensin—aldosteronesystemaRerthechronicrenalinjuryanditcouldproVideexperimentaleVidencef．orclinicalapplication．TheSDfemaleratswereusedinthisstudywithnomlaldiet，CsA30mg．kg一．d～wasadministratedorallyfor4weeks．ChaiLing‘rangandvalsartanweregiVenorallyintreatedgroup．Bloodureanitrogen(BUN)，serumcreatinine(Scr)，creatinineclearancerate(Ccr)，reninactiVity(PRA)，angiotensinII(AngII)andotherindicatorsaswellasrenalAngiotensinI(AngI)mRNA，angiotensinII(AngII)mRNAandminer-alocorticoidrec印tor(MR)mRNAweredetected．Disordersofrenin-angiotensin—aldosteronesystem(RAS)inCsAchronicn印hIDtoxicitywereexploredandtheroleofChai1ingTangtoantagonisechronicCsAn印hrotoxicityhasbeenstudied．Method：Healthy40f．emaleSDratsweight200士1Ogwereusedinthisstudy．AReroneweektoadapt，ratsrandomlydiVidedinto4铲oups：Contr01group，CsAgroup，V-alsartallgroupandTCMgroup．AnimalswithCsAtreatedweregiVenCsA30mg．kg～．d-1byorally．SameVolumeof01iVeo订wasgiVeninControlgroup．Inaddition，ValsanaIl1Omg．kg～．d．1andChaiLinTang39．kg～．d‘1thatdissolVedint印waterweregiVenintreatedgroupsfor28days．TheurinewascollectedinmetaboliccageseVeryweekendandbodyweighttoweigh．ARerthelastadministration，theanimalswerefastedfor12hoursandexecutedforbloodthatgothroughrapidcentri凡gation．ConservationofsamplesofsellJm，alldplasmasamplestobeusedforsemmcreatinine(Scr)，bloodureanitrogen(BUN)test，andcalculatedcreatinineClearancerate(Ccr)．Kidneyswerefixedby4％parafomaldehydeforpath0109icalchanges．Reninactivity(PRA)，angiotensinII(AngII)andotherindicatorsaswellasrenalAngiotensinI(AngI)mRNA，angiotensinII(AngII)mRNAandthemineraloconicoidreceptor(MR)mRNAweredetectedtoeValuatetheefrectofChaiLingTanginCsAnephropathy．Result：①Renal如nction：Comparedwiththecontrolgroup，selllm5 英文摘要——————————————————————————————————————————————————————一creatinine(Scr)andureanitrogen(BUN)wereincreasedsignificantlywhileitscI．eatInlneclearancerate(Ccr)wasdecreasedinCsAgroup(PO．05)，whiletheexpressionofAngIImRNAwasdown-regulatedinTCMgroup(PO．05)．Conclusion：lCsAinducedrenalinterstitialinju拶andcontributedtotheincreaseofbloodureanitrogen(Scr)，serumcreatinine(BUN)anddecreaseofcreatinineclearance(Ccr)．Renaltllbulointerstitialpath0109yshowedasignificallceofrenaltoxicitydamage．Itcontainedtheincreaseofpositionofcollagenandinfiltrationofinnammato眄cell．2ChaiLing1’anghadtheI．oletoreducethebloodureanitrogen(BUN)andsemmcreatinine(Scr)，increasecreatinineclearancerate(Ccr)andimproVerenal如nction．3’ShaiLing1’anghadther01etoreducethe1eVeloftheselllmandtissueofPRA，AngⅡandtheexpressionofACE．ItplayedanimportantroleinimproVingthe910memlarfiltrationrateandrenalprotectiVeefrectthroughtheblockofRASsystem．4ChaiLing1hngcouldreducetheexpressionofAngImRNAandAngIImRNAinthekidneV．7 英文摘要Keywords：ChaiLing7Ihng；cyclosporine；chronicrenaltoxicity；kidneydamage；reninactivity；angiotensinI；angiotensinII；mineralocorticoidreceptOr8 研究论文柴苓汤对环孢素A慢性肾毒性大鼠RAS系统的作用．▲上．-J一刖置环孢素A(cyclosporinA，CsA)是目前应用于器官移植后免疫治疗的钙调素抑制剂。CsA在进入细胞后与细胞溶质的亲免疫因子(c舛os01icimmunophilin)细胞溶质蛋白18或40(cyclophilin18or40)结合，结合后的复合物具有抑制钙调素的作用。钙调素是一种非常重要的细胞内信号传导的磷酸酶，通过抑制钙调素可减少白细胞介素II的转录，而白细胞介素II在急性肾移植排斥中起着重要作用。有关报道指出自使用CsA以来移植肾病人一年存活率上升至80％以上，成为治疗器官移植后抗排斥反应的一线药物。CsA常见的副作用有肝损伤、肾毒性、神经毒性、高血压、高血脂以及心血管系统的损害等。其中慢性CsA肾毒性的发生率较高，即使CsA的血药浓度维持在正常范围内，仍有慢性肾损害的发生，并且为不可逆，这极大限制了临床应用。本研究采用CsA灌胃复制CsA慢性肾毒性大鼠模型，给予利水解毒、疏肝健脾中药柴苓汤干预。观察肾功能，肾脏病理，测定血清及组织中肾素活性(PRA)、血管紧张素II(AngII)水平，测定肾脏中血管紧张素转化酶(ACE)、血管紧张素I(AngI)mIⅢA、血管紧张素II(AngII)mRNA以及盐皮质激素受体(MR)mIⅢA表达，进一步探求RAS与CsA慢性肾毒性的关系，从组织、分子、基因水平研究柴苓汤的作用机制，为中药治疗CsA大鼠肾毒性提供科学的实验依据。材料与方法1实验材料1．1实验动物选用清洁级雌性SD大鼠40只，体重200士109，由河北医科大学动物实验中心提供(动物合格证号：SCXK(冀)2008一1．003)，于清洁动物室饲养，室温18℃。24℃，相对湿度50％．80％，按清洁级大鼠的要求饲养。1．2药物 研究论文柴苓汤：由日本TSMURA株式会社提供。每袋9克，其中含生药：柴胡79、黄芩39、半夏59、人参39、甘草29、生姜lg、大枣39、泽泻59、茯苓3卧猪苓39、白术39、桂枝39，以上药物共煎，提取69，加入黏合剂至99。缬沙坦(批号：800994)：缬沙坦由北京诺华制药有限公司提供。环孢素软胶囊(批号：090401)：环孢素由华北制药集团新药研究开发有限责任公司提供(规格：25mg)。1．3试剂与仪器1．3．1试剂血、尿肌酐测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。碘[125I]血管紧张素II放射免疫分析药盒，购自北京普尔伟业生物科技有限公司。碘[125I]血浆肾素活性(PRA)放射免疫分析药盒，购自北京普尔伟业生物科技有限公司。1．3．2仪器与材料756MC型紫外．可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)GeneAmpPCRsystem9700(ABAppliedBiosystems公司)电泳仪及电泳槽(北京六一)紫外透射仪(北京鼎国)超低温保存箱MDF．382E(日本SANYO)高速冷冻离心机1．15K(美国Sigma)电热干燥箱DGB．20(上海光华仪器厂)水浴箱201．O(天津泰斯特仪器有限公司)恒温水浴震荡器CU600(姜堰市医疗器械有限公司)OLYMPUS全能显微镜BX．UCB(日本OLYMPUS公司)LEICARM2245石蜡切片机(莱卡上海分公司)’、凝胶图象分析系统(ScionImage4．O．3．2图象分析系统)2试验方法2．1动物分组及动物模型的建立40只大鼠随机分为对照组(Controlgroup)、模型组(CsAgroup)、缬沙坦组(Valsanangroup)、柴苓汤组(TCMgroup)，每组10只。①对照组：在无菌条件下，对照组给予橄榄油30mg·kg～·d-1经口灌服。②模型组：造模 研究论文动物给予CsA30mg·kg～·d_l经口灌服。③缬纱坦组：造模同模型组。此外，缬沙坦组予缬沙坦lOmg·kg～·d～。④柴苓汤组：造模同模型组。此外，柴苓汤组予柴苓汤39·kg～·d～，自来水溶解后经口灌胃。常规饲养，自由饮水，共28天。3标本的采集及制作3．1生化指标：实验中每周末将动物放入代谢笼中，收集24小时尿量，并测体重。末次给药后，禁食12小时，断头取血，待用于血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)的检测，并计算肌酐清除率(Ccr)。3．2石蜡切片的制作及染色3．2．1脱水包埋及切片左肾组织采用4％多聚甲醛固定，经过梯度脱水、透明、浸蜡及包埋，制成3“m厚的切片用于HE染色、Masson染色。3．2．2苏木素一伊红(HE)染色步骤．二甲苯脱蜡10min×2次；100％酒精洗去二甲苯1min×2次；95％酒精2min，90％酒精2min，85％酒精2min，每级2次；蒸馏水，3min；苏木精染色5min，蒸馏水洗1min；0．5％盐酸酒精速洗20s，蒸馏水速洗，1％淡氨水浸泡30s，蒸馏水洗1min，光镜下检测细胞核分色程度；流水冲洗，3min；1％伊红染色3min，蒸馏水洗30s；85％酒精脱水20s，90％酒精脱水30s，95％酒精1min，光镜下检测红蓝色对比程度；100％酒精2min×2次；二甲苯5min×2次；中性树胶封片。3．2．3．Masson染色步骤石蜡切片脱蜡下行至蒸馏水；苏木精染色5．1Omin，蒸馏水洗1min；O．5％盐酸酒精速洗20s；流水冲洗5—10min；丽春红酸性品红液中染5．8min，蒸馏水洗30s；1％磷钼酸中染1．3min；不用水洗，直接入苯胺蓝液5min；1％冰醋酸处理jmin；95％酒精脱水并洗去冰醋酸；1oo％酒精脱水2min×2次；二甲苯透明5min×2次；中性树胶封片。3-3血清及组织肾素活性(PRA)、血管紧张素II(AngII)：采用放射免疫分析法测定。3．4免疫组化检测ACE表达石蜡切片脱蜡下行至蒸馏水；PBS浸洗5min，用滤纸将组织周围的水分吸干；3％过氧化氢，室温下孵育，20min；PBS清洗3次，每次5min； 研究论文枸橼酸缓冲液(pH6．O)微波炉内修复，98℃维持lOmin；冷却至室温；PBS清洗3次，每次5min；滴加非免疫性血清封闭，室温孵育，30min，倾去液体，注意勿沈；加入一抗，4℃过夜；PBS清洗3次，每次5min；滴加生物素标记的二抗，室温60min：PBS清洗3次，每次5min；滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素，37。C孵育30min；PBS清洗3次，每次5min：DAB显色2min，光镜下控制细胞显色程度，5．20min；自来水充分冲洗，终止显色；苏木素复染细胞核；常规酒精逐级脱水，二甲苯透明，树胶封片。以镜下出现棕黄色颗粒为阳性表达。以PBS替代二抗作为阴性对照。3．5ImPCR检测血管紧张素I(AngI)mRNA、血管紧张素II(AngII)mI矾A以及盐皮质激素受体(MR)mIⅢA表达。3．5．1总I冰A的提取取肾脏组织100mg左右，置匀浆器中；加入适量的而zol用匀浆器匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状；转入新的离心管中，室温静置5min；4℃12000rpm离心5min，小心吸取上清液于另一离心管；加入1／5体积的氯仿，震荡混匀后室温静置5min；4℃12000印m离心15min；转移上层水相到另一离心管中，加入等体积的异丙醇，然后充分混匀后室温静置lOmin；4℃12000rpm离心10min；IⅢA形成白色的小团沉淀在离心管的底部和侧面；尽量弃上清；加入75％的酒精1ml；4℃12000印m离心5min；尽量弃上清；RNA沉淀；干燥IⅢA沉淀5．10min；加入DEPC处理的蒸馏水50ul，55．60℃孵育lOmin，使RNA充分溶解。取少量溶解的RNA，用TEBu脓系时候于紫外分光光度计260和280nm处读取A值，A260／A280=1．8．2．O间方可使用，总RNA浓度=A260×稀释倍数×O．04(u咖1)，用前调整为lu咖l。3．5．2逆转录反应取总RNA2ug，加入RT反应体系(含AMVBu低r，dNIPs，OligodTPrimer，AMV，RnaseInhibitor等)管中，并用DEPC处理水补足到50ul反应液体积，震荡混匀后短暂离心，加入少量矿物油于PCR仪42℃30min(cDNA合成)，99℃5min(逆转录酶失活)，5℃5min，．20℃保存备用。3．5．3PCR反应 3．5．3．1PCR扩AngI上游引物5’下游引物5’AngII上游引物5’下游引物5’MR上游引物5’下游引物5’RatGAPDH上游引物5’下游引物5’3．5．3．2PCR反dNTPs5U1，Ta加DEPC至50“l。3．5．3．3PCR反应条件：PCR扩增条件：94℃变性3分钟(94℃40s，各自的退火温度50s，72℃90s)30个循环；72℃延伸5分钟。3．5．4半定量分析取每个标本的扩增产物1Oul于1％的含GV核酸染料的琼脂糖凝胶电泳，以DNAMarker(DL2000)作为标准分子量标记，电泳后于紫外投射仪观察，并用数码照相机照相，输入微机应用法国VL公司BIO．PROFIF凝胶图像分析系统对目的电泳条进行分析，以相应的内参电泳条带作为参照，结果以两者之积分吸光度的比值表示。4观察指标4．1～般状态观察：大鼠死亡率、精神状况、大鼠皮毛、饮食、尿量、体重、活动及对外界刺激的反应等。4．2生化指标：血清尿素氮(BUN)采用二乙酰．肟法测定，血清肌酐(SCr)和尿肌酐(Ucr)采用苦味酸法测定。计算肌酐清除率(Ccr)，应用公式：肌酐清除率=尿肌酐×24h尿量／血肌酐／1440。4．3光镜观察：左侧肾组织行HE、Masson染色，光学显微镜下观察病理 研究论文改变。4．4血清及组织肾素活性(PRA)、血管紧张素II(AngII)：采用放射免疫分析法测定。4．5血管紧张素转化酶(ACE)：采用免疫组织化学检测。4．6血管紧张素I(AngI)mRNA、血管紧张素II(AngII)mRNA以及盐皮质激素受体(MR)mRNA表达：采用RT-PCR检测5统计学处理方法：使用SPSS17．Oforwindows统计软件分析数据资料。各组数据均进行正态性检验，数值变量以均数加减标准差(i士s)表示，各组数据比较前先进行方差齐性检验，满足正态性及方差齐性，采用单因素方差分析，多组比较采用方差分析(ANOVA)，组间比较采用LSD检验。所有假设检验方法均以O．05为显著性水准。结果1各组大鼠的一般情况对照组大鼠精神状况、活动、毛发、饮食、饮水、尿量等无明显改变。模型组精神萎靡、活动差、饮食、饮水量下降、毛发变黄、松乱、部分脱落。缬沙坦组一般状况好于模型组。柴苓汤组大鼠较模型组明显改善。2柴苓汤对CsA慢性肾毒性大鼠尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、肌酐清除率(Ccr)的影响结果见(TablelFigl，2，3)从实验结果可见：与对照组比较，模型组大鼠血肌酐和尿素氮显著上升，肌酐清除率降低(PO．05)，柴苓汤组大鼠AngIImRNA表达明显降低有显著性差异(PO．05)。 Fig．1研究论文附图(x士S)Fig．2comparisonofVarianceofscramongf．ourgroups(曩士s)一-__————————————————————————————————————————————————————————————一16 Fig．4coInparisonofv撕anceofSemmPRA锄ongfourgroups(x士S)17 研究论文oups(x士S)Fig．6ConlparisonofVarianceofTissuePRAamongf．ourgroups(x士S)——————————————————————————————————————————————————一18 研究论文Fig．7ComparisonofVarianceofTissueAngII锄ongfourgroups(x士S)Fig．8ComparisonofVa^anceofAngI／GAPDHamongfourgroups(x士S)19 研究论文Fig．9Comp撕sonofVa^anceofAngII／GAPDHamongfourgroups(x土S)Fig．1OComp撕sonofyarianceofM刚GAPDHamongfourgroups(x士S)20 Fig．11HistopathologyinCSAratswithHEstaining(1O×20)一————————————————————————————————————————一21 研究论文Fig．12HistopathologyinCSAratswithMassonstaining(1O×20)≯雾器委瓣诤：童j’一：．，j”074乏：；咚、鬈；：。。：j?。jj。。j：|tj、。》。-j：tt：，耄j?～。、：≮jio、一√。7：：4，。j9≯鬈。咚j∥∽X0：警≯，‘≯孽薹，三j'。j，7；7：。。，；?：?i≮：s?|．7j14{：Ii{5，：j鬟《芒■。；7．；?；“!≯jj?一■』擘}t，i7％p‘，。+：。1。：毒4，i‘。o∥。≯，．≯．”：。∥-。70“；。。≯COntroI，’|^，一汽⋯。编‰纰2盖咆毫乏磊缸赫惫≥鬻瓣露≥’，，善，’：毒?；善；≯j0≮。i≥强≥’!三一≤搴0≯摹≮。≯：薯≈擎?√j10⋯j_‰?：j’■，毒j0，，．，。?7’i。，，}。．：j⋯，：，I，j≯。j’!“，÷．。。：：；，一．，，j}，。7，’。．：j。≯*铲，-j≯。j’鼍“，，吨．e·，。：iTCM+孪净二i*事。～iFig．13ExpressionofACEinCsAratswithimmunohistochemist巧(1O×20)22孑一㈣0、；流．。●礓；钞一。淑，，咖％，貔。*”≈，辑～簪，j}¨。暂，轧箍k移='一览。_、|≯蝴 23 堑垄垒查．一——_——————————————————————————一一附表Table1BuN，sc!竺璺g!!!翌竺兰全垡!!兰圭兰2．——二——_—_——_—。——。——。——————————一。groupBuN(mm011兰!墨!!!巴竺!尘!竺!塑里!!翌!呈2一．!!一-—————÷————————————————一Contr016．3450士1．05379．117士3．511O．54士O·03CSA11．395士1．824木99．067士5．426水O．28士O·05’。‘Val8．615士O．878▲87．817士13．189·O．34士O·06水TcM7．16Q圭Q：鱼Z2：墨三：2三三圭2：三三2：．竺：三主圭竺：竺三璺：．一————————————-——●————————————一一Note：宰vscontrolgroupPlO母mol／L)增加细胞内Ca2+的水平并提高细胞色素P450的活性，所以它对肾小管重吸收则起抑制作用。AngII对肾脏非血流动力学效应为：①AngII促进生长和促纤维生成的作用：AngII可以促进系膜细胞、肾小球血管内皮细胞、肾小管上皮细胞的增殖以及间质纤维化。AngII主要通过调节细胞内多种生长因子来调节系膜细胞的增殖和肥大，例如转化生长因子．p(TGF—p)。TGF．p是一种非常重要的促纤维生成调节因子，系膜基质的增加主要靠其调节；AngII通过ATl来介导肾小球内皮细胞增殖，这个过程有赖于促有丝分裂蛋白激酶的磷酸化的诱导；AngII导致的上皮细胞肥大由ATl介导并使细胞周期停滞于Gl期；此外，炎性细胞浸润、间质成纤维细胞增殖以及过多的细胞外基质(ECM)积聚是公认的导致纤维化的因素。而AngII的血流动力学效应和非血流动力学效应均证实其与肾脏间质纤维化的发病机制有判11l。首先，AngII能使成纤维细胞的表型转变为肌纤维细胞，细胞增殖后侵入肾小球以及周围区域，导致基质在此沉积。给予AngII刺激后，还可以通过TGF．p介导，出现ECM蛋白的表达和生成增加。其次，AngII不仅能促进基质的积聚，还可以通过肾组织中产生的蛋白酶抑制剂，减少基质的降解。②AngII作为促炎症因子的作用：AngII通过调节正常T淋巴细胞表达、分泌细胞因子(RANTES)合成、巨噬细胞特异性趋化蛋白．1(MCP．1)以及核因子1(B(NF．1(B)来促进炎性细胞浸润。AngII刺激RANTESmRNA表达和蛋白合成，而RANTES对巨噬细胞、T淋巴细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞具有趋化功能，并且能够引起嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞脱粒，从而刺激T淋巴细胞增生；AngII通过ATl的诱导刺激MCPmRNA和蛋白的表达1121；AngII能激活NF。KB，NF—KB是一种非常重要的促炎症因子，主要调控包括RANTES在 研究论文内的多种基因的转录ll引。AngII主要作用于ATl发挥作用。ATl主要分布于心脏、血管、肾脏、肾上腺等器官和组织。当ATl受体被激活时，可以促进醛固酮的释放，增加水钠潴留和血容量。醛固酮包括两种类型，即循环醛固酮和组织醛固酮。循环醛固酮是由肾上腺分泌的类固醇，而组织醛固酮是在肾上腺以外部位生成的。组织醛固酮入血后能快速发生水解反应，失去乙酞基转变为循环醛固酮。组织醛固酮的作用主要是通过盐皮质激素受体(MR)来介导的。虽然皮质醇的浓度是醛固酮的1000倍以上，然而MR对两者的亲和力基本上是相同的。这是因为醛固酮的靶细胞中含有11．p羟类固醇脱氢酶(11p—HSD)，它可将皮质醇转化为与MR亲和力极低的皮质酮，阻断皮质醇与MR的结合，最终确保醛固酮与MR选择性结合。醛固酮不仅能维持机体水和电解质平衡，还可以促进肾小球硬化和肾间质纤维化【141。它能刺激系膜细胞产生IV型胶原和纤维连接蛋白【15】，还可以刺激肾小管上皮细胞合成TGF．p。而TGF．p高表达是肾小球硬化和肾小管间质纤维化的主要致病因素。给予醛固酮受体阻断剂能抑制TGF．p的升高说明这种作用是通过MR实现的。被醛固酮活化的肾小管上皮细胞还能促进肾间质成纤维细胞合成I型胶原(C01．I)¨酬。这说明肾脏组织醛固酮参与肾脏纤化过程。而使用醛固酮受体阻断剂后，不仅能使肾脏间质C01．I减少，而且肾小管的TGF．p、纤溶酶原激活物抑制物．1(PAI—1)表达也明显下调，这提示肾脏组织醛固酮的促肾间质纤维化作用可能与上述因子的参与有关。此外，醛固酮增强AngII与血管平滑肌细胞(VSMC)结合，使AngII受体的表达上调，并且呈时间剂量性相关117’18，19l。2．3CsA慢性肾毒性肾病中RAS的作用使用CsA后，可以激活RAS系统，大量的研究已经证实RAS可能参与了CsA慢性肾毒性的发病【2们。CsA对lo：S的作用主要体现在以下几个方面：①导致肾功能下降：CsA能引起肾脏血管的收缩，特别是以入球小动脉为主。这种作用使。肾血浆流量(RPF)显著下降，进而肾小球滤过率(GFR)显著下降，最终导致肾功能的恶化121，22，231。CsA收缩血管的作用涉及到多种因子，其中包括收缩血管的内皮素(endothelin，ET)，血栓素(thromboxane，TXA)和AngII以及舒张血管的前列腺素(prosta91andin，PG)和一氧化氮(NO)等。②导致肾小管间质纤维化：包括RAS激活AngII后促纤维化作用 研究论文和促醛固酮释放。CsA能激活RAS，上调肾素、AngI和AngII等的表达。AngII作为RAS主要的效应因子可通过非血流动力学作用直接介导。肾平滑肌细胞、系膜细胞和小管上皮细胞等增生以及诱导转化生长因子(TGF—p)的合成。其中，TGF—p是导致。肾纤维化最重要细胞因子12训。它不仅能在体外增加肾纤维化细胞促进产生I、III、Ⅳ型胶原及纤维连接素，而且能够减少基质金属蛋白酶(MMP)和促进基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)的合成。TGF．D还可通过受体信号传导促进细胞合成胶原蛋白、纤连蛋白、层连粘蛋白以及蛋白多糖等，这些均证实TGF—p是肾纤维化重要的调控因子1251。此外，醛固酮活化在CsA肾损害的进展中也有着重要的作用，主要是通过盐皮质激素受体(MR)而发挥作用。醛固酮可促进。肾小球硬化和间质纤维化。而MR可导致严重的肾小球和肾小管间质的炎症，并可以被醛固酮受体抑制剂螺内酯阻断，这也进一步表明这种作用是通过MR介导的。MR还可导致肾小球硬化和间质纤维化12副。因此，醛固酮与AngII共同影响肾脏局部血流、纤维化和组织重构。2．4柴苓汤对CsA慢性肾毒性肾病的保护作用2．4．1柴苓汤对CsA慢性肾毒性大鼠肾功能保护作用血肌酐为含氮的有机物，而尿素氮是蛋白质代谢的终末产物。在肾功能正常时，这些物质从肾小球滤出。而当肾小球滤过率下降到正常的50％以下时，血肌酐和尿素氮因潴留而增高。血肌酐的生成量和尿的排出量较恒定，肌酐大部分是从肾小球滤过，不被。肾小管重吸收。肾单位时间内，把若干毫升血浆中的内生肌酐全部清除出去，称为内生肌酐清除率，可反映肾小球滤过功能和粗略估计有效肾单位的数量。血肌酐、尿素氮、内生肌酐清除率是目前检测肾功能的常用方法。本实验结果显示：与对照组比较，模型组大鼠血肌酐、尿素氮含量明显升高，胪'酐清除率明显降低(PO．05)。这表明柴苓汤可下调肾脏AngImRNA、AngIImRNA的表达，通过阻断RAS来抑制肾小球硬化和肾间质纤维化，起到肾功能保护作用，从而延缓慢性肾毒性的进展，有关中药对MR的作用，有待进一步研究。3中医对CsA慢性肾毒性的认识以及柴苓汤的立法依据和组方特点在中医古典医籍中没有关于CsA慢性肾毒性的记载，依据临床表现，其应归属于中医“水肿"、“腰痛"、“虚劳"、“关格”等范畴。本病病程较长，病机错综复杂。《黄帝内经》日：“肾主水，受五脏六腑之精而藏之”。若邪毒“壅积于肾，留聚膀胱，治不及时，或治未得法，久则必致损伤肾体，耗伤肾气，而致肾脏虚损，甚则肾精失藏，开合失职，脉络伤损，固摄无能，精浊难分，阴精外泄，邪浊内聚，水湿滞留，致成以肾脏虚损为主，或虚实相兼的病证。"CsA在肾移植术后一方面发挥着积极的免疫抑制剂的作用，一方面作为“药毒”蓄积体内，阻遏气机，导致肝气郁滞。肝失疏泄，影响脾脏，致脾失转运，水湿内停；邪毒伤肾，肾阳不能温煦脾阳，脾运化功能失职；肾气亏虚，肾失蒸化，开阖失司，水液停聚。故早期基本病理变化主要为水湿停聚，肝气郁滞，治疗以疏肝理气利水为主。浊毒内蕴，阻滞脉道，气机阻滞而成血瘀，久则瘀毒互结，更伤。肾气，肾的藏泄功能更弱，且经脉不利可致水液运行不畅，加重浊毒；水湿内停又阻滞血液的运行而加重血瘀。故在早期治疗基础上应加入活血化瘀之品。本病的病理因素主要为水、气，病久致瘀，病位在肾、肝、脾，属虚实夹杂之证，治疗以疏肝理气、利水泄毒为法。针对本病病机，我们采用利水解毒、疏肝健脾的中药柴苓汤干预，使肝气调达，脾肾健旺，水肿消退。柴苓汤由《伤寒杂病论》中的“小柴胡汤"和“五苓散”组合而成。柴苓汤的方剂名称，首见于南宋杨士流《仁斋直指方论》，方剂组成则在元代危亦林《世医得效方》中有明确记载。经《丹溪心法》传承于世。柴苓汤由“柴胡、黄芩、半夏、人参、甘草、 研究论文生姜、大枣、泽泻、猪苓、茯苓、白术、桂枝”等药物组成，共计12味中药，具有利水解毒、疏肝健脾的功效。方中柴胡、黄芩、桂枝、生姜解表和里，人参、甘草、大枣、桂枝补气和营，泽泻、茯苓、猪苓、白术利水泄浊解毒，柴胡、半夏、茯苓、白术舒肝健脾和胃。柴苓汤在古代一般用来治疗伤寒泄泻身热、伤风伤暑阳明疟、麻疹痘疮病气等病证，症见身热、口渴、腹泻、小便不利等。在现代柴苓汤治疗的疾病，以水液代谢障碍性疾病、自身免疫性疾病为多见。曹智勇1291等的研究表明柴苓汤具有免疫调节、抗炎、抗变态反应、消除活性氧自由基等作用，可以增强类固醇疗效，减少类固醇用量，减轻类固醇副作用130’31l，并有减轻蛋白尿、利尿消肿作用03扪。李平等的实验证实1331，柴苓汤中的最有效成分是柴胡皂甙2d，柴苓汤可以减少尿蛋白，改善肝肾功能，对炎性细胞浸润有明显抑制作用，减轻系膜细胞的增生和系膜基质的扩张，对不同的水负荷状态有双向调节作用，能够减轻皮质激素的不良反应。柴苓汤能够减轻肾小球的病理损害，减轻肾小球系膜细胞的增生和系膜基质的扩张，减少新月体的形成，同时抑制CD8+T细胞在大鼠肾小球周围和肾小管间质的浸润，巨噬细胞的积聚、活化以及TGF．p1和I型胶原在肾组织中的表达，减缓慢性肾病进展【34'3剐。结论1采用CsA灌胃诱导肾间质损伤，导致大鼠尿素氮、血肌酐升高，肌酐清除率降低；肾脏组织病理显示肾小管间质胶原成分显著增多和炎性细胞浸润等肾损害表现。2柴苓汤可以降低尿素氮、血肌酐，提高肌酐清除率，减轻肾功能损伤。乙3柴苓汤能够抑制肾素活性，降低血清及组织中AngII的水平，下调ACE的表达，通过阻断RAS系统，起到改善肾小球率过滤和肾功能保护作用，从而延缓慢性肾毒性的进展。4柴苓汤可下调肾脏AngImRNA、AngIImIⅢA的表达。 研究论文参考文献1RoseS，GreesfeldZ，BrezisM．Chroniccyclosporine—inducedNephropathyintherat[J]．Transplantation，1990，49：445—4522LeeDB．Cyclosporineandtherenin-angiotensinaxis[J]．KidneyInt，1997，52：248—2603ShihabFS，AndohTF，1、annerAM，eta1．Roleoftransfominggrowthfactor-betalinexperimentalchroniccyclosporinenephropathy[J]．KidneyInt，1996，49：114l-11514乔保平，张亚伟，李道明．大鼠口服环孢A慢性肾毒性模型的建立[J]．中华器官移植杂志，2000，21(3)：158．1615郭啸华，刘志红，黄海东．百令及其提取液对大鼠环孢素A肾毒性的防治作用[J]．肾脏病与透析肾移植杂志，2003，12(3)：223—2286RoseS，GreesfeldZ，BrezisM．ChroniccyClosporine—inducedNephropathyintherat[J】．Transplantation，1990，49：445—4527NeuyenGDelarueF，BurckleC，eta1．PiVotalr01eoftherenin／proreninreceptorinangiotensinIIproductionandcellularesponsetorenin[J]．JclinInvest，1996，109：1417-14278NeuyenGDelarueF，Berroul，eta1．Specimcrec印torbindingofreinonhumanmesangialcellsincultureincreasesplasminogenactiVatorinhibitou-Ia11tigen[J】．kidneyInt，1996，50：1897—19039贺明．肾素．血管紧张素系统在调节肾脏活动和慢性肾功能不全中的作用【J】．生理科学进展，2004，35(2)：188．192lOTokeA，MeyerTW，eta1．Hemo-dyllamiceffectsofangio—tensinIIinthekidney[J】．ContribNephrol，2001，135：34—4611“ngYNancyA，WayneA．Therapeuticstrategiestohaltrenalfibrosis[J]．Cullr0pinPhanlflacol，2002，2：177—18l12HilgersKF’HartnerA，PorstM，eta1．Monocytechemoattractantproteinandmacrophagein矗ltrationinhypenensiVekidneyinju叫[J]．KidneyInt，2000．58：2408—241913WblfGButzmannU，W色nzelU．Angiotensinsystemandprogressionof35 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综述综述环孢素致慢性肾毒性以及防治的研究进展环孢素A(CsA)是目前广泛应用于器官移植的免疫抑制剂，其中肾移植一年成活率和移植肾一年成活率分别达到97．1％和89．5％Ill。但是CsA也具有非常明显的副作用，其中以中毒性肾损害最为严重，限制了CsA的应用。本文就CsA的肾毒性及其防治的研究进展作一简要综述。1环孢素致慢性肾毒性临床表现应用CsAl2个月以上的肾移植或非肾移植患者均会出现慢性肾功能不全。肾移植患者考虑慢性排异，而非肾移植患者则考虑CsA肾毒性。CsA慢性肾毒性临床表现为肾小管间质纤维化、肾小管萎缩以及肾小动脉特别是入球小动脉玻璃样变性，有时还可引起阻塞性小动脉病与肾小球硬化或塌陷(collapse)，最终可导致肾功能丧失【2】o这种肾功能不全和CsA急性肾毒性不同。CsA急性肾毒性是由于入球小动脉收缩引起肾小球滤过率(GFR)下降以及肾功能急剧恶化，是功能性的，呈时间剂量依赖性，减量或停用CsA后肾功能可恢复正常；而CsA慢性肾毒性表现为进行性，停用CsA不能恢复【31。对肾移植患者的长期研究发现，接受CsA治疗的大多数病人肾功能没有进行性恶化。约10％的心脏和心肺移植病人肾功能进行性恶化，停用CsA不能恢复。进一步研究表明，CsA的初始剂量、男性性别及急性肾功能衰竭可能是CsA慢性肾毒性的危险因素14】。2环孢素慢性肾毒性所致肾脏病理改变2．1肾小球病变15】：①肾小球旁器肥大②肾小球局灶或节段性硬化③肾小球血管有血栓性和增生性改变④毛细血管袢内纤维血栓形成的溶血性尿毒综合征样改变⑤有时可见膜细胞的损伤和破坏，以及肾小球基底膜的增厚2．2肾小动脉病变：①内膜玻璃样变②结节样蛋白沉积③平滑肌细胞坏死2．3肾小管病变16】：①肾小管空泡变性②肾小管微小钙化③肾小管坏死④远端小管毛细血管充血2．4肾小管间质病变：①肾皮质区不规则的灶状或带状的小管萎缩②带状间质纤维化3发病机制 综述3．1CsA的直接肾毒性作用Nelsol7】认为，CsA肾中毒是由于CsA沉积于肾小管细胞形成空泡，并沉集于管腔和毛细血管袢发生栓塞而引起的。通过肾脏活检，显示出移植肾中有大量的CsA沉淀。因此，用适当的溶媒改变CsA的细胞分布，能够降低CsA的肾毒性。NasbeqerL18l发现临床用作CsA介质的Cremophor对LLC．PKl细胞具有细胞毒性。CasasA19】等报道用鱼油代替橄榄油作为CsA的介质可使CsA肾毒性大为改善。3．2CsA对肾素．血管紧张素．醛固酮系统(RAS)的作用有报道指出RAS系统对介导CsA的肾毒作用发挥重要作用。己证明CsA可引起血浆肾素活性(PRA)增加，伴有肾功能减退和高血压的发展。此外，CsA刺激血管内皮细胞以及肾小管系膜细胞分泌血管紧张素II(AngII)。AngII是一种血管收缩介质，理论上可促成急性肾毒性血流动力学改变的特征，而且迄今资料提示其可能在慢性肾毒性的发病机制上发挥重要作用。AngII可直接刺激骨桥蛋白(OPN)来促进纤维化。动物实验表明大鼠用AngII长时间处理能引起肾间质细胞增生和纤维化并产生类似于CsA慢性肾毒性的病理变化110】。AngII还可以刺激转化生长因子(TGF．p)在肾脏表达。TGF．p是一个致纤维化作用的因子11l】，也是炎性细胞趋化因子。它直接刺激细胞外基质的合成，减少胶原酶的产生，引起间质纤维化，最终导致肾损害。用血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素受体抑制剂阻断可改善CsA引起的纤维化，降低TGF．p，减少基质沉积。由此可见，阻断RAS系统，抑制PRA，减少AngII的生成可能有益于延缓慢性CsA肾毒性的进程。3．3CsA对内皮素(Endotheli玑ET)的作用ET是一种具有强烈缩血管性质的多肽，由21种氨基酸组成。CsA可刺激ET在肾脏细胞的合成和释放。ET可刺激肾小球上皮细胞和系膜细胞增值，强烈收缩肾脏血管，刺激细胞外基质产生以及释放炎性介质等112】。很多研究表明，ET．1与CsA中毒性肾损害有关。细胞培养证列13，14l：CsA刺激内皮细胞释放ET．1；动物实验表明115l：口服CsA大鼠，尿中ET．1水平上升，肾组织中ET训刚A表达上调。3．4CsA对一氧化氮(NO)的作用NO是新型细胞内信使和神经递质，也是强烈的血管舒张因子。其通 综述过氧化亚氮合成酶家族(NOS)由L．精氨酸合成。NO也参与CsA诱导的慢性肾毒性作用。体外培养细胞表明116J：CsA诱导肾小球和系膜细胞增殖成时间依赖性收缩，NO供体SIN-厶邕阻止上述效应，提示CsA肾毒性与NO途径有关。动物实验表明117l：CsA肾毒性可能与其刺激血管收缩有关，补充精氨酸，促进NO的合成，从而促进血管扩张效应，减轻肾功能损害。3．5CsA对前列腺素(Prostaglandin，PG)和血栓素(n啪mboxane，TXA)的作用PG是一种强烈扩血管因子，特别是对肾髓质的血管扩张作用，维持肾血流量(RPF)和肾小球滤过率(GFR)。TXA由PG衍生，可引起血小板凝聚及血管收缩，与PG作用相反，两者动态平衡以维持血管收缩功能及血小板聚集。而二者的失衡在肾毒性的发生上起着非常重要的作用，二者均可被CsA改变。动物实验表明：CsA可增加尿中血栓素B2的排出，它与肾功能降低有关，表现为血肌酐(Scr)升高及肌酐清除率(Ccr)下降。给予血栓素合成酶抑制剂可显著减少肾脏血栓素B2合成，并改善肾功能。临床研究也证实血栓素合成酶抑制剂可提高肾移植患者由于CsA肾毒性所致的肾小球滤过率下降。3．6CsA对Ca2+浓度的作用细胞内钙作为一种间接介质，可加强其对内源性血管收缩的作用，引起肾内血管的收缩。有资料表明，细胞内Ca2+浓度增加可直接刺激平滑肌细胞和系膜细胞的收缩。已证实Ca2+拮抗剂对CsA肾病有一定的保护作用，但没有足够的资料证明其对移植肾的功能和存活有确切好处。3．7CsA对P．糖蛋白(P．gp)的作用P．gp是目前CsA肾毒性发病机制研究的新热剧18，19】。P．gp是阳离子异生物素和代谢产物的排泄泵。它可以从细胞中排出疏水物质，包括免疫抑制剂CsA。这可能涉及酶解产物通过细胞膜的能量依赖转运—类似“疏水分子真空清洁器”。当P．gp的功能被CsA阻滞时，P．gp对抗CsA毒性代谢产物的解毒功能降低，导致CsA堆积，激活成纤维细胞，导致间质纤维化120】O3．8CsA对核因子KB(NF．1(B)的作用NF．1出作为一种转录调节因子进入细胞核内后可以诱导和调节一系列与肾脏损伤有关的因子，例如免疫球蛋白、白细胞介素等，从而导致肾加 综述脏产生病理效应。肝．KB在各种因子相互影响和作用的复杂网络中，作为转录调节因子，起着中心调控作用【211。3．9CsA对基质降解蛋白酶抑制剂的作用在肾脏纤维化的进展期，两种基质降解蛋白酶抑制剂即金属蛋白酶组织抑制因子一l(TIMP．1)和纤溶酶原激活物抑制剂．1(PAI．1)的表达明显增加。CsA刺激成纤维细胞增加表达TIMP．1及增加内皮细胞与上皮细胞I和Ⅳ型胶原的表达。3．10CsA对血红素加氧酶(H0)的作用HO是血红素分解代谢的主要酶类，其中HO．1是机体调节和抵抗氧化应激反应的重要生物分子1221。其抗氧化作用是通过消耗氧分子，从而直接减轻组织的氧化应激损伤，发挥细胞保护作用。细胞内H0．1的提高现被公认为是氧化应激的标志1231。付艳红等通过免疫组化检测到H0．1在CsA慢性肾毒性大鼠肾脏组织有表达，并且主要集中在肾近曲小管，部分远曲小管。但是与正常大鼠相比，H0．1的表达明显减弱1241。3．11CsA对成纤维生长因子(bFGF)的作用bFGF是肾脏成纤维细胞的有丝分裂原，可促进肾小管细胞再生并向成纤维细胞转化1251。有研究表明，在CsA慢性肾毒性动物模型中bFGF表达较强。4CsA慢性肾毒性的诊断和鉴别诊断CsA慢性肾毒性的临床表现不具特异性，尤其是急性肾小管坏死恢复期合并CsA肾毒性或急慢性排斥反应合并CsA肾毒性时不易鉴别。应用免疫染色后典型的排斥反应为CD25+CD8+细胞增加，HLA．D刚Lu5比值也增加。CD25阳性是排斥反应最好的标志，敏感的特异性均超90％；KvoM【26l等则提出一套细胞计数规则系统(cytodiagnosticalgonhm)以鉴别排斥反应和CsA。肾毒性。取新鲜晨尿作经典P印nicolaou检查和免疫细胞化学染色检查，早期CsA中毒通常只有肾小管细胞，而排斥反应和晚期CsA中毒则肾小管细胞和淋巴细胞均有增加(>2000个／尿)。此外，通过超声和核磁共振对急慢性排斥反应的确诊率分别达到80％和64％。在急性排斥期，超声显示肾体积增加，形状类似方形，肾椎体突出，。肾周围模糊不清，而慢性排斥期肾体积减小，肾椎体缩小；核磁共振诊断急性排斥反应的标准为肾皮质髓质边界不清，肾窦周围脂肪组织减少或消失。CsA慢性肾毒性的确诊 综述一般是通过肾脏组织活检。通过病理活检证实肾脏近曲小管上皮细胞中大小较一致的空泡样变和肾小球附近的细小动脉玻璃样变是CsA毒性损伤的重要病理变化，对指导临床诊断CsA肾毒性有重要意义。有关学者还检测了肾活体组织中淋巴细胞协同刺激分子在急性排斥反应和慢性排斥反应有不同的表达，有助于CsA肾毒性的鉴别。5CsA肾毒性的防治5．1改变药物介质以鱼油代替橄榄油作为CsA的介质。鱼油中含有二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)，这些成分可通过与花生四烯酸竞争环氧合酶和脂氧合酶来抑制花生四烯酸代谢，减少血栓素A2(TXA．2)和大肠杆菌不耐热性肠毒素(LTB．4)的合成，抑制肾脏血管收缩。这一作用可改善CsA引起的肾毒性损害并可降低排斥反应发生【期。5．2监测血药浓度监测环孢素的血药浓度，注意调整剂量，控制毒副作用的发生。当出现CsA慢性肾毒性后，常减低CsA的剂量，使血药浓度低于400n咖1。临床上一般应用低剂量的CsA长期维持或停用CsA，以减轻其慢性肾毒性损害【2刚，但同时也可能诱发急性或慢性排斥反应。5．3联合用药5．3．1钙离子拮抗剂Ca2+拮抗剂中二氢吡啶类的伊拉地平、非洛地平、硝苯地平，苯硫氮卓类的地尔硫卓和苯烷胺类的维拉帕米都是较理想的CsA肾毒性预防药物129】。其作用机理为改善CsA代谢，允许应用小剂量的CsA达到合适的血药浓度及免疫抑制效果，减轻CsA引起的肾血管收缩【30’311；另外可抑制肾脏ET。1的合成，还可限制Ca2+内流，保护线粒体免受CsA损害。中药汉防己甲素为一种钙离子拮抗剂，闵志廉报道132J：在大鼠实验中，应用CsA50m∥kg造成CsA中毒后，如果加用汉防己甲素(10m∥蚝)腹腔注射，可明显减轻近曲小管空泡变性，降低超氧化物歧化酶活性以及改善肾功能。5．3．2血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI类药物)ACEI类药物包括依那普利、贝那普利、卡托普利等。其作用机理为抑制AngII的生成，通过激活缓激肽进一步激活纤溶酶原激活剂，使金属 综述蛋白酶活化，最终导致血管舒张和ECM降解。ACEI类药物对很多慢性进展性肾病，如梗阻性肾病、小管间质疾病、狼疮性肾炎、糖尿病肾病等均有保护肾功能。5．3．3血管紧张素受体拮抗剂(ARB类药物)AIm类药物包括氯沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦等。其作用机理为：AngII通过作用于靶器官上两种膜受体(ATl和AT2)产生各种生物学效应。激活ATl受体使血管收缩，调节水电解质平衡。通过激活AT2受体可以拮抗ATl介导的促细胞生长、细胞增殖及升压反应。很多研究发现，拮抗ATl受体可降低血压，改善肾小球滤过率，减少蛋白尿，抑制小管间质炎症，防止肾小球硬化133l。Burdmann等的研究表明【34l：洛沙坦可减轻CsA引起的慢性纤维化。5．3．40【受体阻滞剂高洁等的研究表明‘35】：抗高血压药哌唑嗪可以改善肾脏血流，对肾脏有保护作用，因此可降低CSA肾毒性。5．3．5核苷类抗病毒药Boissonnat的研究表明136l：核苷类抗病毒药更昔洛韦可有效降低血清肌酐、尿素氮水平，而使谷丙转氨酶、总胆红素水平上升，表明更昔洛韦可减少CsA肾毒性，并且减少巨细胞病毒感染的发病率，提高人／肾的存活率，但有增加肝毒性的潜在危险。5．3．4前列腺素(PG)P印anikolaou等报道【37】：发生环孢素性肾损害时，应用PG．1有协同的免疫抑制作用，并可缓解环孢素引起的血管收缩，逆转环孢素肾损害，减低排斥反应发生率。5．3．5血栓素(TXA)合成酶抑制剂Smeesters【381对慢性CsA肾毒性大鼠应用TXA．2合成酶抑制剂后发现TXA2的合成明显减少，间接使PG的合成增加，使TXA．2／PG．1的比值下降，肾功能和肾脏形态学均有明显改善。5．3．5胰岛素增敏剂噻唑二酮类胰岛素增敏剂罗格列酮(RGZ)，不仅能改善机体胰岛素抵抗，还具有抗炎、抗脏器纤维化及影响细胞增殖和转型等作用，与肾脏疾病有密切的关系【39，加1。董吉的研究进一步证实‘41l：RGZ在肾脏疾病中发 综述挥的抗炎、抗纤维化以及减少肌酐清除率的下降的作用。RGZ能够减轻CsA引起的组织学改变，延缓肾功能恶化的进展速度。5．3．6茶多酚(TP)王仙的研究证实142】：给予TP可以显著增加肾脏抗氧化能力，抑制诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达，从而有效改善CsA所致肾功能衰竭、肾小管变形及空泡变性。另一方面，Shi等研究亦证实【43】：TP可以通过有效抑制CsA所致肾小管细胞和间质细胞的调亡来改善CsA肾性，因此TP缓解CsA肾毒性的作用通路可能是一个较为复杂的过程。5．3．7番茄红素(LP)辛艳飞的研究表明Ⅲl：LP能有效拮抗CsA所致的大鼠肾功能衰竭的作用机理可能与LP能够增强CsA大鼠抗氧化能力有关。LP可有效增加肾脏抗氧化能力，逆转CsA所致的大鼠体重下降和肾功能衰竭，降低大鼠血清SCr和BUN以提高体内Ccr；组织病理学检测也证实LP可有效的拮抗CsA引起的肾小管萎缩。5．3．8姜黄素姜黄素是从中药姜黄中提取的一种酚类物质，可通过升高血红素加氧酶．1(HO．1)的水平和降低成纤维生长因子(bFGF)的水平来发挥抗氧化、抗炎和抗纤维化作用，使肾脏的氧化损伤、炎性和纤维病变减轻，而HO．1水平的下降和bFGF水平的升高是否有协同作用，有待进一步研究。5．4中医对慢性环孢素肾毒性的治疗5．4．1活血化瘀药物：代表药物有丹参、川芎等。丹参能够改善肾脏微循环和血流动力学、调节组织修复和再生、抑制氧自由基对生物脂膜层的超氧化反应及减少脂质过氧化物的生成并加快其清除。陈氏研究指出【45】：CsA肾毒性与脂质过氧化有关，而复方丹参注射液具有抗氧自由基作用及增强机体和肾脏的抗氧化能力，从而达到防治CsA肾毒性的作用；川芎亦为活血化瘀药，可有效阻止静脉注射环孢素A引起的大鼠肾小球滤过率、肾血浆流量的下降以及血小板聚集强度的增高，从而发挥抗CsA肾毒性的作用。5．4．2益气养阴药物：代表药物为冬虫夏草、人参等。冬虫夏草可以改善肾血流动力学，保护肾小管离子转运功能，改善肾间质水肿、纤维化程度及细胞内线粒体呼吸功能来实现对肾功能的保护 综述1461。而人参总甙可清除体内反应性氧代谢产物，抑制CsA引起的大鼠血肌酐升高1471。23456789参考文献张维明，李克儒．环孢素的。肾毒性及防治研究进展[M]．《国外医学》泌尿系统分册，2000，20(1)：19．21AhnKO．InnuenceofangiotensinIIonexpressionofton一1ikerec印torandmaturationofdendriticcellsincl啪niccyclospo血en印hropathy[J]．T啪splantation，2007，83(7)：938—947MorozumiK，TakedaA，UchidaK，eta1．CyclosporineNepllrotoxicity：HowdoesitafIfectrenalallograR向nctionandtransplantmo印h0109y[J]．Trans—plantationProceedings，2004，36(2)：251-256LiC，LimSW，AhnKO．InfiltrationOfnestin-expressingcellsininterstitial丘brosisinchroniccyclosporinenephropathy[J]．Trans-plantaIion，2008，86：571—577Gri伍thsMH，CroweAV，PapadakiL，eta1．Cyclosporinn印hrotoxicityinheartand1ungtransplantpatients[J】．QJM，1996，89(10)：751—763AnaratA，NoyanA，GonlusenG，eta1．Innuenceofenalaprilonexp舐mentalcyclosporinAn印hrotoxicity[J]．PediatrN印hrol，1996，1O(5)：616—620NelsonNA，RobinsTG，PortFK．SolVentnephrotoxicityinhumansandexpedmentalanimals[J】．AmJNephrol，1990，10(1)：10-20Nassbe玛erL，Be玛strandA，D印ier】neJW．AnelectronandnuorescencemicroscopicstudyofLLC-PKlcells，akidney印ithelialcellline：normalmo印hologyandcyclosporinA·andcrem叩hor-inducedalterations[J】．IntJExp—pathol，l991，72(4)：365-378CacasA，HotterG，RoselloCataf．auJ，eta1．ProstaglandmsLeukotEssentFattyAcids，1995，52(1)：49-53ShallgMingHua，YuanWeiJie．IntrarenalactiVationofreninangiotensinsysteminthedevelopmentofcyclosponneAinducedchronic45 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个人简历一、一般情况姓名王筝性别女民族汉出生年月籍贯二、个人经历l984年11月22日河北省鹿泉市2003．吵一2008．72008．9一今于河北医科大学临床学院就读，获得医学学士学位于河北医科大学攻读中西临床医学硕士学位三、发表文章中国现代百名中医临床家丛书．赵玉庸．中国中医药出版社，2010．4赵玉庸教授治疗慢性肾盂肾炎经验介绍．新中医，2010，42(12)：157．158．赵玉庸教授泻浊法治疗慢性肾衰竭经验验案举隅．中国中西医结合肾病杂志，2011，12(1)：6—7柴苓汤对环孢素A肾病大鼠肾小管上皮细胞表型转化的抑制作用．中国中西医结合杂志，2011，31(1)：94·98肾上腺髓质素缺失对单侧输尿管结扎小鼠MMP．1／TIMP一1表达的影响．中国老年学杂志，20lO，30(6)：775—778“肾络瘀阻"病机学说及临床应用．中华中医药杂志，20lO，25(5)：702．704依那普利对环孢素A急性肾损伤小管上皮细胞坏死及再生的作用．中国药理学通报，20lO，26(7)：906．9红花对肾间质纤维化实验大鼠肾小管上皮细胞表型转化的抑制作用．中国老年学杂志，2009，6(29)：1344—1346