水貂绿脓杆菌(pasd03株)鞭毛蛋白的免疫保护性研究

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1、万方数据ImmunoprotectiveefficacyofFlagellinfromMinkPseudomonasAeruginosa(PASD03strain)Thesissubmittedto@ngdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomyWuJuan(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine)Supervisor：Prof．ShanHu，Prof．

2、QinXiaobingQingdao．ChinaJune，2013万方数据独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：功廖年厂月冲日I关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文

3、的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：％侈年厂月巧13导师签名：岙吃舛v时间：≯∥年乡月呷日‘万方数据壹璺壅些太堂亟±堂位监塞擅墨水貂绿脓杆菌(PASD03株)鞭毛蛋白的免疫保护性研究摘要绿脓杆菌(铜绿假单胞茵)(Pseudomonasaemginosa，PA)可引起人及多种动物发病，是一种严重危害人类健康及畜牧业发展的重要致病茵。近年来，

4、随着毛皮动物养殖规模的扩大，疾病竹发生也逐年增多，尤其是细菌病的危害加大，由水貂绿脓杆菌导致的水貂出血性肺炎常表现为群体的急性暴发，水貂前期咳嗽，后期体温升高，呼吸困难，口鼻流血，死亡率逐年增高。绿脓杆菌对外界的抵抗力极强，由于II缶床治疗中抗菌药物的广泛使用，以及不合理应用，导致绿脓杆菌耐药菌株不断出现，耐药谱不断扩大，同时也加剧了抗菌药物在水貂体内的残留，严重威胁我国皮毛业的发展，给人类造成极大的经济损失。此外绿脓杆菌血清型众多，不同血清型菌株其免疫原性不尽相同，给绿脓杆菌疫苗的研制带来很大困难。我国养殖业中的绿脓杆菌耐

5、药情况已是十分严重，且呈现多重耐药特性。因此获得一种理想的疫苗来预防水貂绿脓杆菌病显得尤为重要。有实验证明鞭毛蛋白是重要的表面抗原，具有种属特异性，且不同血清型之间具有相同的鞭毛蛋白免疫原，能产生交叉保护作用。鉴于绿脓杆菌感染的普遍性，以及鞭毛蛋白的特点，本研究通过提取的鞭毛蛋白，并结合小白鼠免疫模型分析其免疫原性，探讨绿脓杆菌鞭毛蛋白疫苗对于绿脓杆菌感染的保护作用，对构建绿脓杆菌抗病疫苗和从根本上防止绿脓杆菌的感染具有重要意义。本试验首先，探索了培养条件对PASD03的鞭毛生长的影响。分别从培养基种类、培养时间及培养温度进

6、行培养比较。通过一系列试验及鞭毛镀银染色，最后确定了提取绿脓杆菌鞭毛的最佳条件：液体培养基摇床培养更适合于绿脓杆菌快速生长，适合鞭毛发育，能在短时间培养内进行鞭毛染色；培养时间从22小时至48小时都能染出鞭毛，而这个时间和细菌生长阶段的对数生长期相吻合，为了进一步确定细菌出现鞭毛的最佳时机，又进行了OD值与鞭毛生长规律的研究，鞭毛染色镜检，绘制生长曲线。结果显示PASD03进入对数生长期，几乎每个时间段都能染出鞭毛，为了保证鞭毛的提取量，必须确保细菌的数量足够大，因此在PASD03刚进入对数期时不易马上进行鞭毛的提取试验，而

7、应再让细茵生长一段时间。即培养时间确定为使细菌进入对数生长期之后的一段万方数据时间；绿脓杆茵在4-42℃范围内都能生长，而鞭毛生长的最佳培养温度为37℃左右。其次对PASD03鞭毛蛋白的提取方法进行研究，分别通过酸裂解、差速离心以及酸裂解结合机械振荡三种方法，用(NH4)2S04盐析来获得鞭毛蛋白，采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE)对提取的绿脓杆菌鞭毛蛋白进行分离纯化，Western免疫印迹检测，并进行电镜鉴定。结果显示，成功分离出水貂绿脓杆菌的鞭毛蛋白，获得了绿脓杆菌鞭毛蛋白的初提液。提纯的绿脓杆菌鞭毛蛋白经

8、SDS—PAGE显示为一条蛋白带，相对分子质量m)为53K．Da；Western免疫印迹检测亦提示条带在Mr53KDa处，透射电镜(SEM)观察表明该鞭毛蛋白呈丝状；三者均证实该蛋白为同一均质蛋白。并且得出：经酸裂解法并结合机械振荡和硫酸铵沉淀法简便、耗时短、纯度高、产量高，适用于绿脓杆茵