鞭毛蛋白增强狂犬病疫苗免疫效果的研究

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1、密级：论文编号：中囯农业科学院学位论文鞭毛蛋白增强狂犬病疫苗免疫效果的研究TheResearchofImmunoenhancewithFlagellinasanAdjuvanttoRabiesVaccine硕士研宄生：肖星星指导教师：殷相平副研宄员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：兰州兽医研宄所研究生院2015年5月密级:论文编号:中国农业科学院学位论文鞭毛蛋白增强狂犬病疫苗免疫效果的研究TheResearchofImmunoenhancewithFlagellinasanAdjuvanttoRabiesVaccine硕士研究生：肖星星指导教师：殷相平

2、副研究员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：兰州兽医研究所研究生院2015年5月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationTheResearchofImmunoenhancewithFlagellinasanAdjuvanttoRabiesVaccineM.S.Candidate：XiaoXingxingSupervisor：Prof.YinXiangpingDegree：MasterofVeterinarianSpecialty:VeterinarianMay2015摘要狂犬病

3、又称恐水病，是由狂犬病病毒引起的、迄今为止人类唯一病死率几乎高达100%的人畜共患中枢神经系统传染病，严重威胁人们的生命安全。目前为止，狂犬病尚无有效的治疗方法。狂犬病疫苗的紧急预防接种是预防狂犬病病毒感染的最有效方法之一。目前，我国动物使用的狂犬病疫苗主要是弱毒活疫苗。但由于弱毒苗存在毒力回复、突变等潜在的安全隐患问题，WHO曾表明家养动物不适合用弱毒苗免疫。所以，要防治狂犬病的发生重要的是研制出更安全有效的疫苗。腺病毒活载体疫苗因其自身的优越性和应用的广泛性，已被应用于狂犬病基因工程疫苗的研究。鞭毛蛋白是鞭毛的主要组成成分。它不仅在细菌运动方面起着重要作用，而且也

4、可以与表达于上皮细胞、单核细胞和未成熟的树突状细胞的顶端和基底外侧的TLR5受体结合，从而诱导分泌前炎性因子和细胞因子，介导激活T细胞和B细胞应答。因此，鞭毛蛋白可以作为疫苗佐剂，增强疫苗的免疫效果，具有良好的应用前景。本试验成功表达并纯化了鞭毛蛋白FljB、FliC和FljB’-FliC。纯化的蛋白与狂犬病毒灭活疫苗（whole-killedrabiesvaccine,WKRV）一起免疫小鼠。小鼠共五组：（(1)PBS;(2)WKRV;(3)WKRV和10μgFljB;(4)WKRV和10μgFliC;(5)WKRV和10μgFliB’-FliC。每组10只小鼠，每

5、隔两周进行一次免疫，共免疫两次。在免疫后0天、7天、14天、21天、28天和35天采血，通过ELISA的方法检测抗体水平。用ELISPOT的方法检测细胞因子IL-4和IFN-γ的变化。抗体结果表明：FljB有望成为WKRV的佐剂；免疫了FliC后能够提高免疫反应，但效果不明显；FljB’-FliC不能提高WKRV的体液免疫反应。细胞因子检测结果表明：FljB诱导产生的Th1和Th2免疫反应要强于FliC；FliB’-FliC不能增强细胞免疫反应。本试验采用腺病毒表达系统，构建了表达狂犬病毒G蛋白、G蛋白与鞭毛蛋白FljB和G蛋白与FliC的复制缺陷型重组腺病毒Ad-G

6、、Ad-GB和Ad-GC。用重组腺病毒免疫BALB/c小鼠，每隔两周免疫一次，共免疫三次。在免疫后0天、14天、28天、35天和42天采血，通过间接ELISA的方法检测狂犬病毒G蛋白的抗体IgG水平。通过ELISPOT的方法检测细胞因子IL-4和IFN-γ的变化。用FCM进行了CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞的检测。抗体检测结果表明：FljB和FliC均有增强体液免疫的作用，并且FljB比FliC的效果好。细胞因子检测结果表明：FljB和FliC均有增强细胞免疫的作用，并且FljB比FliC的效果好。FCM检测结果表明：FljB和FliC均能够增强诱导T

7、h和Tc细胞的增殖。综上所述，鞭毛蛋白FljB和FliC无论是在狂犬病毒灭活疫苗中还是在腺病毒共表达G蛋白和鞭毛蛋白的基因工程疫苗中，均有免疫增强作用。并且，FljB总体上来说比FliC的增强效果更显著。表明了FljB有望成为狂犬病疫苗的佐剂，从而为研制安全、高效的狂犬病疫苗提供一定的参考作用。关键词：狂犬病疫苗，原核表达，鞭毛蛋白，腺病毒载体，免疫IAbstractRabies,alsoknownashydrophobia,istheonlyhumanfatalityratealmostupto100%ofthezoonoticandcentral