水貂绿脓肝菌flic基因表达及其对小鼠免疫效力的研究

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1、ExpressionoffliCGeneandImmuneEvaluationInMiceInducedbyRecombinantProteinofMinkPseudomonasAeruginosaThesissubmittedtongdaoAgriculturalUniversittjInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomy——一Author：YangPeipei(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine)Supervisor：Prof．Shan

2、Hu，Prof．QinXiaobingQingdao．ChinaJune，2012独创性声明啪洲咖咖帅啪咖砌硼蛐Y2332691本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：扔碚砖时间：劫J羔年／月；p日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送

3、交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：．扔如锄时间：Ⅵ，土年钿弓口日导师签名：时间：协12年；月；口日水貂绿脓杆菌fliC基因表达及其对小鼠免疫效力的研究摘要绿脓杆菌可以引起人和多种动物感染发病，是一种危害人类健康及畜牧业发展的重要条件致病茵。一直以来，人们希望能找出预防和控制该茵感染的有效方法。近年来发现绿脓杆菌具有广谱耐药性，其对大多数防腐剂和抗菌药物表现为天然或获得性多重耐药，所

4、致感染可供选择的有效抗菌药物越来越少，使临床治疗的难度不断增加。此外绿脓杆菌血清型众多，不同血清型茵株其免疫原性不尽相同，给绿脓杆菌疫苗的研制带来很大困难。有实验证明fliC基因是所有绿脓杆菌共同具有的基因，其编码的鞭毛蛋白是重要的表面抗原，具有种属特异性，且不同血清型之间具有相同的鞭毛蛋白免疫原，能产生交叉保护作用。鉴于绿脓杆菌感染的普遍性，以及鞭毛基因的特点，本研究克隆和表达f1iC基因，并结合小鼠免疫模型分析其免疫原性，探讨绿脓杆菌鞭毛蛋白疫苗对于绿脓杆菌感染的保护作用，对构建绿脓杆茵fliC基因工程疫苗和从根本上防止绿脓杆菌的感染具有重要意义．首先对山东地区分离

5、的不同来源绿脓杆菌进行鞭毛抗原基因分型，以确定貂源绿脓杆菌的主要流行血清型。分析比较OenBank登录的绿脓杆菌fliC基因序列，根据保守区域设计分型引物，以提取的细菌基因组DNA为模板，扩增fliC基因的部分片段，根据片段大小确定鞭毛类型(A型或B型)，对两种类型代表株的扩增产物进行测序分析，验证PCR分型方法的可靠性，最终得出山东地区貂源绿脓杆茵的流行血清型为H抗原基因A型。其次对两种类型代表株fliC全基因进行克隆与序列分析。根据Genbank登录的A型和B型fliC基因序列分别设计引物，在引物的上下游分别引入酶切住点BamHI和肋oI，扩增两种鞭毛类型代表株PA

6、SD01和PASD03的fliC(A型fliCll85bp、B型fliCl467bp)全基因，按常规方法克隆到pMDl8-T载体，制备重组质粒，然后导入大肠杆茵DH5Q中，用蓝白斑实验初步筛选可疑阳性克隆。可疑阳性克隆进一步进行特异PCR和酶切鉴定后对插入片段进行测序，并将测序的序列与已知序列进行同源性比较。最后对A型鞭毛菌f1ic基因进行原核表达，并初步分析其免疫原性及免疫保护性。将测序鉴定正确的A型fliC基因从pMDl8-T-fliCA阳性克隆中纯化、回收，与表达载体pGEX一6P一1连接，并转化大肠杆菌DH5o【中，得到基因工程茵，经酶切和测序鉴定正确的阳性克隆

7、命名为pGEX-6P-I-f1iCh。将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达，表达产物进行SDS-PAGE与Westernblot鉴定，可产生相对分子量约为66KD的表达产物，表明成功构建了f1iC蛋白的重组表达系统。以诱导表达的融合蛋白免疫家兔，制备兔抗鞭毛蛋白免疫血清，通过试管凝集试验测定抗体效价在1：640-1：1280之间，证明表达的融合蛋白具有较高的免疫原性，可作为亚单位疫苗的候选抗原。通过小鼠主动保护试验，计算小鼠存活率为90％以上，证明表达的鞭毛蛋白具有很好的的免疫保护性。关键词：水貂；绿脓杆菌；