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1、一株水貂犬瘟热病毒的分离与鉴定摘要2013年7刀，临沂诸城某水貂养殖场发生传染病一例，养殖场规模大约在7000只左右，平均每天死亡十几只，对养殖户造成很大的经济损失。临床症状为精神萎靡，食欲不振，眼、辱流出黏性分泌物，个别严重病例发生腹泻，伴有神经症状。剖检可见帅脏出血严重，肠粘膜脱落，肝脏有针尖状出血点、质脆易碎。采集发病水貂的肝、脾、肺、脑等组织，通过RT-PCR检测确定是犬瘟热病毒(CDV),测序分析发现：该病毒与NCBI上发布的登录号为EF042819、KC590511、KC667070的毒株同源性均为
2、96%以上，将阳性样品接种Vero细胞，通过细胞培养传代获得病毒一株，并命名为CDV-SDo关键词：水貂犬瘟热病毒RT-PCR细胞培养OnecaseofminkforisolationandidentificationofCaninedistempervirusAbstract:July2013,onecaseofinfectiousdiseaseoccurredinaminkfarminLinyi.About7000minkswereinthisfarmwhileadozenofminksweredeadda
3、ily,whichcausedgreateconomiclossesforthefarmers.Theclinicalperformanceswerelistlessnessjossofappetite.stickysecretionswitheyesandnose.someseriouswithdiarrheaandNeurologicalsymptoms.Aftertheminkwasdissected,thelunghemorrhage,intestinalmucosalsheddingandlivern
4、eedle-likebleeding,brittleandfragilewereappearedinthemainpathologicalchanges.TheLiver,spleen,lungandbrainwerecollectedandconfirmedCDVbytheassayofRT-PCR.ScqucncingAnalysisreleasedthatthevimsweremorethan96%homologywiththeoneswhoseGenBanknumberswereEF042819、KC5
5、90511andKC667070onNCBI.ByinfectingtheVerocellwiththepositivesample,wegotoneviruscalledCDV-SDKeywords:Mink;CDV;RT・PCR;Cellculture犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的犬和食肉目小许多动物的一种高度接触传染性传染病。犬瘟热病毒属于副黏病毒科麻疹病毒属，基因为单股负链RNA。在室温下，该病毒相对不稳定，尤其对紫外线、干燥及50〜60°C以上的高温敏感。病毒可在犬肾、牛肾、鸡胚成纤维细胞及Vero细胞上
6、生长繁殖。在研究屮Vero细胞是增殖病毒的首选细胞，CDV会导致细胞出现CPE,表现胞浆出现空泡、细胞逐渐圆缩，甚至拉网，最后脱落死亡。1、材料与方法1.1材料1.1.1试剂与仪器TaKaRa一步法RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司；核酸提取试剂盒购自AXYGEN；MEM培养基和胎牛血清均购0HyClone公司(美国);PCR仪为Eppendorf公司生产；凝胶成像与分析仪购自Bio-RAD；Vcro细胞由本实验室保存1.1.2引物信息引物序列：CDV15，・GGTTTACCCTTGGTGGTTAGT・3'
7、CDV25，・ATGGTGCCTGCTTTGGTC・3'1・2样品的采集及处理无菌采集水貂的①肺脏、肝肌、脾脏②肠③脑，分别放到三支干净的离心管小剪碎，然后加入PBS适量，反复冻融三次，4°C,6000卬m/min,离心2分钟，取上清，・80°C保存备用。1.3RT-PCR检测病毒基因组总RNA的捉取按AXYGEN核酸捉取试剂盒的说明进行。犬瘟热病毒RT-PCR反应体系为：CDVI(20gM)0.5yL,CDV2(20yM)0.5yL,EnzymesMix12gL,RNA3yL,加ddHzO补足25yL体系,将
8、体系混匀置于PCR仪中，设定程序为：50°C30min,94°C2min,94°Clmin,55°Clmin,72°Clmin,33个循环，72°C延伸lOmin,取6
9、iL反应产物于1%琼脂糖凝胶上电泳。1.4病毒序列测定将病毒核酸送至上海生工进行克隆测序，选取测序结果的N基因部分氨基酸序列与NCBI上发表的登录号分别为EF042819、KC59051RKC667070的氨基酸序列进
