犬瘟热病毒的分离、鉴定与单克隆抗体的研制

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华中农业大学2011届硕士学位论文AbstractCaninedistemper(CD)isahighlycontagiousandfataldiseaseofdogsorothersusceptibleanimalswhichinfectedbycaninedistempervirus(CDV)．Atpresent,caninedistemperispandeIIlicinChinaandbecomesolleofthemostseriousdiseasesfordogbreedingindustry．Accordingtothecharacteristicsofcellculture，thestudyisolatedastrainofcaninedistempervirus(CDV)attenuatedstrainfromSecondUnitedattenuatedsampleinVerocellsusinghereroviusantiserumblockingassaying．TheCPEinVerocellfeaturinggatheredshedding,rounding,net-balloonanddeathappearedsteadilyaftergenerationcultivation．ThediseasedcellsidentifiedbyRT-PCRshowedpositive．ThephysicsandChemistryexperimentsshowedthat,theviruswasinactivated56"Cfor30min，moresensitivetochangesofacidity．ThestrainhelditsvirlxLeneestabilityinpH7．O～8．0environmentbutsensitiveabovepill0．0andbelowpH4．0．CDVisanenvelopedvires，losseditsinfectionactivityafter20minutes诚tllchloroform．TheHAtestshowthat，CDVcouldnotagglutinateredbloodcellofchicken，pig，sheepandrabbit．TheTCID50ofCDVattenuatedstrainis10-6．25／mL．The6to8weeksoldBALB／cfemalemicewereimmunizedsubcutaneously、析tlICDVOonderstepoortstrain,whichWaspurifiedandconcentratedwitllpolyeth，7leneglyc01．Afterbeingimmunizedthreetimes，themicewereboostedintraveinally、ⅣitIlequalthedoseforthefinalimmunization．Threedayslater，spleencellsfromimmunizedmicewerefusedwithSP2／0myelomacells．Afterrepeatedscreeningandsubcloning，5hybridomacelllineswereobtainedwhichcouldsteadilysecretemonoclonalantibodyagainstCDV．Theywerenamed：1G5、2D7、386、4C7and4G5。Monoelonalantibodiesin5linesallhadhigherspecificitytoCDV,whiehdidnotreact、析tlladenovirustypelIandcanineparvovirus．TheIFAtestshowedthatallthe5mAnscanreactwithVerocellsinfectedbyCDV．Theascitestitersof5hybridomacelllineswere1G5>100x2lo、2D7>100x29、386>100x27、4C7>100×28、4G5>100x210．thetiterofcellcI．tLturesupematantWas2s"--29．Theheavychainsinmonoclonalantibodiesof5myelomacelllinesbelongedtoIgG1andlightchainsbelongedtoKchains．Keyword：Caninedistempervirus；isolation,identification；MonoclonalantibodyⅡ 犬瘟热病毒的分离、鉴定及单克隆抗体的研制缩略词表(Abbreviation)III 犬瘟热病毒的分离、鉴定及单克隆抗体的研制综述皇不J￡犬瘟热(CanineDistemper)，是一种急性、高接触性和致病性的传染病，该病由犬瘟热病毒(Caninedistempervirus，CDV)引起。犬瘟热病毒的宿主范围非常广，据报道，现已经从犬、狐狸、貉、狼、老虎、狮子、浣熊、熊、大熊猫等动物体内分离出犬瘟热病毒。自1972年来，水貂与狐狸的养殖在我国迅速发展，致使该病的爆发数量急剧增加，该病的致死率在30％．80％，雪貂可高达100％，对经济动物、野生动物以及实验动物等造成了极大的危害。l病原特征1．1CDV的理化特性犬瘟热病毒属于副粘病毒科麻疹病毒属，同属的其他病毒还有麻疹病毒、小反刍兽瘟疫、牛瘟病毒、海豚瘟热病毒等，病毒呈圆形或不规则形形状，有时候也会出现长丝状，病毒粒子直径在150"--300nm之间，在蔗糖溶液中的浮力密度为1．180～1．218，峰值为1．195。CDV为有囊膜病毒，容易被氯仿、酒精、、甲醛等有机溶剂灭活，对阳光、干燥、热、紫外线都很敏感，所以病毒对环境的抵抗力很低。65℃，30rnin就可让病毒失去活性，病毒对酸碱均很敏感，在pH4．0以下或者pill0．0以上时，病毒活性会大大降低。病毒在室温环境可存活数天，2～4℃数周，低温冷冻可保存数月，目前所发现的CDV均属于同一血清型，不同毒株的宿主范围、培养特性和毒力有一些差异。目前常见的毒株有A75／17、Ledefle、Rockbom、Convae、SnyderHill(SH)、Onderstepoot，其中SnyderHill株，被称为标准株，接种犬可以使95％的犬发生脑炎症状，而其他野毒株的分类尚不明确。1．2CDV的分子生物学特点CDV是负链、不分节单股RNA病毒，外面包裹一层囊膜。螺旋状的核衣壳包裹着病毒的RNA，核衣壳由核蛋白、磷蛋白和巨大蛋白构成，其中核蛋白是主要成分，核衣壳呈线性排列，宽约15---17rim。由细胞膜和脂类衍生而来的病毒囊膜包裹在核衣壳的外周，中间有基膜蛋白，基膜蛋白的主要作用就是连接核衣壳和囊膜，囊膜上有1．3nm左右的杆状纤突，纤突由H和F两种糖蛋白组成，纤突含血凝素，不含神经胺酶(杨应丽，2006)，病毒基因组长度为15690bp，分子量为6×106Da， 华中农业大学2011届硕士学位论文呈线性排列，由一个短的3’端前导区和编码核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血细胞凝集素蛋白(H)和巨蛋白(L)等6个结构基因及编码V蛋白和C蛋白2个非结构蛋白的基因和5’端尾随序列(Trailerregion)组成(SidhuMSeta1．，1993)。每个基因上有各自的开放性阅读框，病毒基因组核酸本身不具感染性，他可以作为模板来转录和复制互补的mRNA及RNA中间体。3’端的非编码区为引导序列，5’端的非编码区为调节序列，主要作用是指导基因组转录和复制，其中含有一个38个核苷酸的序列，该序列是核衣壳蛋白衣壳化的起始位点。1．2．1核蛋白基因和核蛋白(N)N蛋白基因是位于病毒基因组56-一1738位的一段长度为1683个核糖核苷酸的序列，该序列内部只含有一个开放性阅读框架，编码长度为523个氨基酸的N蛋白，N蛋白分子量为58Kda(WienerDetal，2007)。N蛋白基因高度保守，据Stettler等(1995)报道，CDV的野毒株与Onderstepoort弱毒疫苗株的N基因同源性为93．8％，共有105个核苷酸不同，其中3’端非编码区有3个，5’端非编码区有5个，编码区有97个(TipoldAeta1．，1992)。N蛋白的同源性为95．2％，可分为三个区：N末端的可变区、C末端的可变区和中间的高度保守区，中间的高度保守区是N蛋白的重要功能区域，病毒RNA的核衣壳化、核衣壳的包装以及N蛋白．RNA相互作用等信息都存在于该区域(StealerMeta1．，1995)，所以该区域在结构和功能上有重要的作用。N蛋白是核衣壳的主要组成成分，并且与CDV的毒力有重要的关系，CDV在中枢神经系统中可引起持续性的感染，这也和N蛋白有密切的关系(HamburgerDeta1．，1991)。N蛋白的保守性较强是麻疹病毒属中主要的交叉抗原，在CDV感染中，N蛋白可诱导机体的早期免疫应答，有报道，在接种病毒9天就可检测到其抗体(P撇JAeta1．。1999)，所以N蛋白抗体检测在犬瘟热病毒的早期诊断中具有重要意义。N蛋白含有B细胞表位和T细胞表位，其中l---80位或者337"-'358的氨基酸有B细胞表位，这一发现是由YoshidE等通过构建一系列的N蛋白基因缺失毒株来证实的(YoshidaEetal．．1999)。T细胞表位是Beauverge等在研究时发现的，他们发现N蛋白在281"～289位的9个氨基酸高度保守，在细胞免疫中发挥重要功能，经过研究证实该序列为T细胞表位。此外，N蛋白还是核糖核蛋白复合体(RNP)的组成成分，RNP可以指导聚腺苷酸化的mRNA及反基因组RNA的复制，RNP还可以指导6个转录单2 犬瘟热病毒的分离、鉴定及单克隆抗体的研制位顺序合成加帽结构。1．2．2磷蛋白基因和磷蛋白(P)P蛋白基因是位于病毒基因组第1742"--3396位的一段长度为1655个核糖核苷酸的序列。该序列内部含有两个开放性阅读框架，这两个阅读框架部分重叠。第1个阅读框架编码长度为507个氨基酸的结构蛋白P蛋白，起始于P基因的第42"-'44位核苷酸，终于第1564"--'1566位核苷酸，第2个阅读框架起始于P基因的第65"-"67位核苷酸，终止于第587"589位核苷酸，编码非结构蛋白C蛋白。P蛋白的分子量为54．9KDa左右，根据实际测得的情况，各毒株分子量有些差异，Convae株的P蛋白分子量为78KDa，而Onderstepoort株P蛋白分子量为66KDa(HakamuraKeta1．，1999)。P蛋白是CDV结构蛋白中第二大蛋白，上面有很多的磷酸化位点，具有聚合酶的功能(cun狮MDeta1．，1992)。P蛋白和位于核衣壳内的L蛋白一起构成了RNA依赖的RNA聚合酶的两个亚单位，两者形成复合物才使得该酶具有完整的酶活性(№acetal．，2001)。P蛋白与包裹RNA模板的N蛋白结合后，使N蛋白的构象发生改变，为RNA聚合酶留出足够的结合空间，使RNA聚合酶能够顺利的阅读模板。1．2．3融合蛋白基因和融合蛋白(F)F蛋白基因是位于病毒基因组第4845"--7049位核苷酸处的长度为2205个核苷酸的序列，该序列内部包含含一个开放性阅读框架(PlattetPeta1．，2007)，内有4个起始密码子，其中位于86"-88、266。268、408-一410处的AUG是完全保守的存在于所有毒株中。第四个密码子在不同的毒株中有些差异，许多分离株和Rockbom疫苗株F基因第461"-463核苷酸处位置是AUA或GUA，而Onderstepoort疫苗株在该位置存在另一个起始密码子。CDV野毒株与疫苗株F蛋白基因的同源性为90．1％，Pascal通过研究发现作为CDV进入细胞的主要密码子AUG主要出现在F2蛋白基因中(PascalCherpillodcta1．，1999)。F蛋白是重要的抗原蛋白，具有抗原决定簇，可以刺激机体产生中和性抗体，同时，F蛋白和细胞膜接触后，会使细胞膜发生融合，从而使病毒进入细胞，所以F蛋白在刺激机体产生保护性免疫反应和病毒侵入机体过程中起着重要作用，与病毒的生物学特性有关，它微小的变化可能致使病毒生物学特性发生改变(乌仁高娃，2004)。用F蛋白作为抗原诱导的免疫反应可以很好的阻止病毒感染，在有病毒增3 华中农业大学2011届硕士学位论文殖的情况下F蛋白诱导的免疫可以抑制症状的发生(WmtersKAeta1．，1983)。CDV野毒株与疫苗株F蛋白的同源性为95．7％，F蛋白的分子质量为62KDa，是一种寡聚糖蛋白，包含F1和F2两个亚单位，两个亚单位之间以精氨酸偶联，形成一个胰蛋白酶的特异酶解位点。F蛋白以前体蛋白FO形式被合成，F0在经高尔基体转运时，被细胞的蛋白酶消化裂解形成F1和F2两个亚单位，然后两单体经二硫键连接形成成熟的F蛋fj(VeronikayonMesslingeta1．，2003；闰芳等，2005)。FO裂解成为Fl和F2蛋白的形式是F蛋白具有融合活性所必需的(1watsukiKeta1．，1998)。F1上有一个糖基结合位点，F2上有三个糖基结合位点，F蛋白具有完全保守的13个半胧氨酸残基和4糖基化位点，这证实不同毒株的F蛋白具有相似的机构和功能。FO通过裂解在N端暴露出一个高度保守的强疏水区，与细胞膜直接作用来诱导细胞膜融合。该融合序列在麻疹病毒中保守性很高，可能与同属其他病毒发生交叉保护现象(SheshberadaranHeta1．，1986)。1．2．4基质蛋白基因和基质蛋白(M)M蛋白基因是位于病毒基因组第3400---4841核苷酸处的一段长度为1442个核苷酸的序列。该序列内部包含1个开放性阅读框架，编码长度为335个氨基酸的M蛋白，M蛋白是病毒粒子中最小的结构蛋白，分子量为34KDa(slli咖iMcta1．,2001)。MV和CDV的M蛋白编码区序列的同源性为67％(Shamunaeta1．，1992)。M蛋白是一种非糖基化表面蛋白，对于副粘病毒科病毒的感染中具有重要意义(BelliniWJcta1．，1986)，可造成慢性、持续性感染，此外，它参与病毒的装配和出芽过程(Olsoneta1．，1996)，在此过程中，它会与细胞膜、胞浆内的核衣壳结构以及病毒糖蛋白的胞质区发生相互作用。病毒在进行核衣壳组装时，在胞膜附近首先将M蛋白翻译出来，然后M蛋白会与病毒核衣壳和病毒糖蛋白相结合，从而使得病毒核衣壳与胞膜互相靠近，在胞膜内滑动的病毒糖蛋白和M蛋白结合后，在M蛋白的牵引下，开始向核衣壳周围靠近、集结，最终将核衣壳包裹，完成出芽过程。此外，在研究病毒RNA合成的调控因素时发现，如果M蛋白发生变异，蛋白介导的细胞膜融合现象就会减少，病毒的感染力也会降低(BelliniWJeta1．，1986)。1．2．5血凝蛋白基因和血凝素蛋白(H)H蛋白基因是位于病毒基因组第7053"--8999位核苷酸处的一段长度为1947个4 犬瘟热病毒的分离、鉴定及单克隆抗体的研制核糖核苷酸的序列。该序列内含有一个起始于该基因第21"-23位核苷酸处的ATG的开放性阅读框架，但是不同毒株的终止密码子位置和序列均有一定差异(岳妙妹，2008)。野毒株的终止密码子是TGA位于H基因的第1842"一1844位，可编码长度为607个氨基酸残基的H蛋白，分子量为84KDa，Onderstepoort株的终止密码子是野丛位于H基因的1833～1835位(Curraneta1．，1991)，编码长度为604个氨基酸残基的H蛋白，分子量为77KDa，(Bolteta1．，1997；Haasela1．，1997)。CDVH基因的变异率很高，Convac株、MV、RPV三者H基因的同源性仅为36％，Convac株与MV的同源性也只有53％(WildTFeta1．，1993)。H蛋白是II型糖蛋白，存在很多的糖基化位点，因为蛋白糖基化程度不同会影响病毒的抗原性(1watsuldeta1．，1997)，所以H蛋白是麻疹病毒属病毒的所有结构蛋白中变异率最高的(1watsukieta1．，2000)，即使是在CDV的不同毒株之间，H蛋白结构也存在较大差异(Alldingereta1．，1993)。该蛋白N末端存在的疏水区，是穿膜的信号序列，同时也是H蛋白的锚定区(Outranetal．，2000)。分离株之间H蛋白的同源性可达93"--99％，在氨基酸水平上野毒株与疫苗株之间存在着10％左右的差异(Carpentereta1．，1998；Mochizukieta1．，1999)。近年来对新分离的病毒的H蛋白基因进行序列分析发现，H蛋白基因存在着很大的差异，这也从一方面解释了为什么近年来CD不断爆发并且难于预防。H蛋白非常适合做对CDV基因改变的监测(Lednickyeta1．，2004)，H蛋白含有许多中和性抗原决定簇，是重要的免疫抗原，能够诱导机体产生中和性抗体，研究发现，用H蛋白制备的单克隆抗体与用F蛋白制备的单克隆抗体相比，其对试验鼠的保护力更强(Hirayamaeta1．，1991)。同时，H蛋白上也发现了可以诱发特异的CTL活性的细胞毒性T淋巴细胞表位(Sixteta1．，1998)。在CDV感染的过程中，首先，H蛋白与细胞表面上受体结合将病毒吸附到细胞上，这与CDV的宿主特异性有关(Wildeta1．，1995)，其次，病毒进入宿主细胞需要CDV的囊膜与宿主细胞膜发生融合，这一过程是在H蛋白的协助下由F蛋白来介导完成的。通过研究发现，靶细胞摄入CDV、子代病毒增殖以及合胞体形成的必需因子是人CD9和其它动物的同系物(Cosbyeta1．，1985)。编码CD9的基因位于人的第12号染色体，CD9是一种蛋白存在于活化的T细胞和前B细胞等细胞表面(Loftieretal．，1997)，F蛋白一般被认为介导了细胞融合过程(Horvathetal．，1992)，然而，H蛋白在启动细胞融合上的重要作用近期被很多研究所发现(Wildel 华中农业大学2011届硕士学位论文a1．，1995)。Stem等通过研究发现采CDV的H和F两个囊膜糖蛋白共同参与了细胞融合的过程，二者分开时不起作用(Steineta1．，1995)。VonMessling等也通过实验证实了细胞的融合能力和H蛋白密切相关(Messlingeta1．，2001)。H蛋白影响着细胞的融合及合胞体的形成，所以对病毒的生长特征也具有巨大影响。1．2．6大蛋白基因和大蛋白(L)L蛋白基因是位于病毒基因组第9003"-'15575位的一段长度为6573个核糖核苷酸的序列，该序列内部含有一个起始于23位的ATG的开放性阅读框架，编码长度为2161个氨基酸的L蛋白，L蛋白分子量约为246KDa。研究发现，L蛋白具有多种酶的功能，病毒的基因组和反基因组的转录和复制均与L蛋白有关，L蛋白还具有特异性RNA聚合酶活性，L蛋白可以在病毒基因组和反基因组模板上有方向性地来回移动，来识别其末端的启动子序列，从而起始转录和复制过程，该过程包括起始、延伸、核糖核菅酸多聚化的终止、甲基化和可能的P蛋白的特异磷酸化等(SidhuMSetal．，1993)。2流行病学本病一年四季均有发生，但是CD的发生还是有一定的季节性，春、冬季节比较多见，本病也具有一定的周期性，周期通常是2～3年。近年来养犬业的迅速发展，使犬的调运更加频繁，所以犬群的免疫水平呈现一种不稳定的状态，这使得该病的发病周期也已经不明显。CDV的宿主非常广泛，但是CDV对不同动物的感染性存在差异，雪貂最易感，通过实验性感染发病率和死亡率可达100％，犬科、触科和烷熊科高度易感。YoshidaE证实猴也可被实验感染，CDV可以在猪的淋巴结内进行复制，但不会引起症状和病毒传播。’’病犬、带毒犬、患CD的其他动物和带毒动物都是犬瘟热的传染源，在肝、肺、脑、肾、脾和淋巴结等多种器官与组织中均可检出病毒，病犬临床症状消失后，也可长时间带毒并不断地向外界排毒，成为隐蔽的传染源。CD传染性极强，只要有一例病例发生会导致同一环境中饲养其他易感动物100％发病。本病主要是通过呼吸道和消化道传播。2月龄以下的幼犬可以通过获得母源抗体来抵抗犬瘟热病毒感染。母源抗体在幼犬体内的半衰期是8．5d，当幼犬体内母源抗体中和滴度大于1：20时，可以抵抗CDV的攻击，断奶至l岁的幼犬是最易发病的，因为母源抗体到8～6 犬瘟热病毒的分离、鉴定及单克隆抗体的研制12周龄时便开始减弱15周龄时基本消失，老年犬和哺乳犬很少发病。CDV侵入机体后首先进入其附近的淋巴结和扁挑体，2"--4天内可在体内大量繁殖并进入血液形成毒血症，病毒可随感染的单核细胞和中性粒细胞扩散到全身的各个器官。由于病毒的迅速增值，可导致很多患病动物产生神经症状，但是也有一些个体因为迅速产生抗体而不出现临床症状。3临床症状犬瘟热病毒感染机体后一般会有3"-'6天的潜伏期，感染病毒的毒力、数量和动物自身的免疫力与潜伏期的长短有很大关系，在病毒感染后的第四天多数动物会表现出体温升高，热型为双向热。犬瘟热的临床症状特征性不强，不同的毒株、个体、犬的年龄、发病阶段和免疫状态起发病症状均不相N(GemmaTWTeta1．．1996)。有些甚至不表现任何临床症状，这给犬瘟热的早期诊断带来一定的困难。感染犬瘟热后，不同的发病阶段，其临床症状随也不相同。开始时主要表现为发热、打喷嚏、流鼻涕类似感冒症状，经过大概3----4天的时间病毒在体内大量繁殖，并进入血液，造成病毒血症，病毒主要感染单核细胞和淋巴细胞，造成机体免疫力的降低，在胸腺、脾脏、淋巴结等免疫器官与免疫组织中可发现大量的病毒，随后病毒会单核细胞与淋巴细胞转移到肝脏、骨髓和脑上并产生一些神经症状，神经症状主要为咀嚼障碍、唾液过度分泌、癫痛、转圈，或共济失调、反射异常、颈部强直等(KoutinasZFeta1．，2002；TipoldAeta1．，1992)，有时还会出现失明与麻痹。Tipold(DeearoNeta1．，2004)等发现，在没有其他神经症状的情况下有时会出现肌肉痉挛现象。只有病程很长，病毒入侵神经系统时才会出现神经症状(于冬梅等，2007)。此外，狐和水貂也常发生犬瘟热，其中狐犬瘟热的临床表现与犬很相似，水貂感染犬瘟热通常会出现三种临床表现即：超急性型，急性型和慢性型。超急性型，为突然发病，看不到前期症状，死亡率通常为100％(殷震等，1997)。急性型，主要临床表现为体温升高(40"-41℃)，食欲下降或拒食，流鼻泪，症状与感冒相似，最后多以死亡结束(苏建青，2008)。慢性型，病貂常出现“硬足掌症"(于冬梅等2007)。4犬瘟热病毒病的致病机理病毒通过气溶胶小滴与呼吸道上皮细胞接触，进入体内进行感染，虽然CDV是7 华中农业大学2011届硕士学位论文一种泛嗜性病毒，可感染体内多种器官，但是对淋巴细胞和单核细胞的感染性最强，破坏机体的免疫系统，所以病毒感染后可导致机体的免疫力降低，并引起继发的细菌感染。在中枢神经系统，病毒呈非裂解性传播，并进行限制性翻译，所以可逃避免疫监视，可引起犬慢性脱髓鞘脑炎。形成脱髓鞘主要有两条途径：体液途径和细胞途径(缪勤，2003)。体液途径是一种自身免疫反应的结果，最后导致的结果是脱髓鞘(缪勤，2004)。在细胞途径过程中，对抗原敏感的T细胞可以激活星形胶质细胞并导致巨噬细胞活化，正常中枢神经系统的髓磷脂会被这些活化的细胞吞噬，从而导致脱髓鞘病变。在早期的脱髓鞘过程中，CD3a和CD8阳性淋巴细胞出现，并且MHC-II轻度上调。慢性脱髓鞘过程中，虽然病毒蛋白减少甚至消失，但会发生强烈的MHC-II反应。据推测，病毒作用于定居细胞直接导致了早期的病变，而慢性病变可能是一种免疫介导的进程，最终导致了病变的发展。有些患病动物出现鼻部、足底表皮角质化增厚，是由于病毒的感染会使一种酶的抑制剂减少，该酶具有促进角质细胞增生的作用。5CDV的实验室诊断CD一旦发生，多数为预后不良，所以在CD的综合防治中，对CDV的鉴别诊断和监测非常重要。根据流行病学资料和临床症状，可以作出初步诊断，但由于早期的的特征性病变不明显，并经常会出现继发性细菌感染和混合感染而使病情复杂化难以确诊，所以CD的实验室诊断非常重要。常用的实验室诊断技术包括：病理学检查、病毒的分离鉴定、血清学检查及包涵体检查，中和试验(SN)(Mainkaeta1．，1994)、酶联免疫吸附试验(ELISA)(Wariereta1．，1998)、免疫荧光抗体技术(FA)(Palmeretal．，1990)、其中免疫荧光抗体技术是目前国际公认的诊断CD的方法，这些方法是检测病毒抗原或抗体，对确诊有重要的指导意义，但也有各自的缺点，比如敏感性不高、特异性差、耗时长等。随着分子生物学技术发展，RT-PCR(李金中等，1999)、原位杂交(Zurbriggeneta1．，1993)、基因序列分析、核酸探针(Oglesbeeeta1．，)等诊断方法可直接检测病料中含有的CDV特异性核酸，使诊断的准确性、特异性和性敏感均大大提高。5．1病毒的分离培养CDV对外界环境中光、热，有机溶剂、酸碱等抵抗力很低，所以病毒的分离成8 犬瘟热病毒的分离、鉴定及单克隆抗体的研制功率很低。此外，不同的发病机体、采样部位、采样时间、和机体的抗体浓度都对分离有影响，但是影响最大的还是所选择的细胞是否敏感。据报道，原代细胞和传代细胞均可用于CDV的分离(房红莹等，1994)。原代细胞主要包括：犬肺巨噬细胞、鸡胚成纤维细胞、外周血淋巴细胞以及犊牛的肾细胞等，其中以犬肺巨噬细胞最为易感，分离的成功率最高(WriSteta1．，1974)，病毒感染犬肺巨噬细胞可以出现CDV典型的葡萄串状细胞病变，但是犬肺巨噬细胞分离很困难，而且容易污染，鸡胚成纤维细胞也可分离CDV，但是初次分离很困难，病毒需要在鸡胚绒毛尿囊膜上多次传代之后才能在适应鸡胚成纤维细胞。传代细胞主要包括：非洲绿猴肾细胞系(Vero)、犬肾细胞系(MDCK)、猫肾细胞系(CREK)、人子宫颈癌细胞系(Hda)以及乳仓鼠胎肾细胞系(BHK-21)等。根据人们的试验发现Vero细胞是CDV分离培养的首选细胞。在分离培养时不可让细胞长的太满，否则敏感性会降低，随着病毒的传代次数增加，病毒出现毒力下降或细胞病变丢失(陈培富等，2004；Kimotoeta1．，1986)。5．2电镜检查该方法是直接检测CDV的一种简便、快速的方法，取样常选择病犬的肝、脾、粪便等，常用的电镜样品制备方法有磷钨酸(PTA)负染色法(李金中等，1999)、超薄切片法(遇秀玲等，2000)、液相免疫电镜(池元斌等，2001)和离子捕捉电镜技术。离子捕获电镜技术具有浓缩、提纯病毒作用，可快速诊断临床样品、细胞培养物和生物学产物中的CDV粒子。但是电镜技术只能观察病毒的形态结构，和同科的病毒很难做出区分(房红莹等，1997)。5．3包涵体检测CDV感染时，在感染细胞内会产生一种特征性形态学变化．包涵体、这可以作为鉴别CDV感染的重要标志。生前刮取鼻、舌、结膜和瞳等部位的分泌物，死后刮取肾盂、胆囊等处的粘膜染色、镜检，可检测到红色、圆形或椭圆形、直径1"'2FIm、边缘清晰的包涵体。包涵体多存在于胞浆，少见于细胞核内，如果包涵体仅见于核内多为传染性肝炎。包涵体内含有病毒抗原(徐在品等，2004)，包涵体检杳有时也出现假阳性，故仅作为辅助诊断(Ducatelleeta1．，1980；遇秀玲等，1994)。5．4免疫荧光抗体(FA)染色法FA主要检测病毒抗原，既可检测体外细胞培养物中的CDV，又可检测病犬脏9 华中农业大学2011届硕士学位论文器中的CDV，还可测定CDV疫苗的效价，同时，FA可在细胞水平对抗原进行定位，FA技术具有特异性强和快速高效的特点，是目前国际通用诊断CD手段(袁书智等，1994；杨白亮等，2004)。5．5酶联免疫吸附试验(ELISA)ELISA检测方法快速、灵敏、简便，当检测的样品规模很大是该方法尤其适合，同时在CD的流行病学调查和CD的免疫情况评估工作中也常用到该方法(池元斌等，2001)。但是在使用ELISA法检测CD时也存在很多的问题，首先要获得包被用的抗原，因为CDV抗原的提纯难度很大，所以在检测时包被抗原常直接选用CDV细胞培养物，这会导致检测时背景颜色很深，不利于观察，这一问题有望采用基因工程手段来解决。间接ELISA法可以被用来检测循环抗体效价，方法是，首先用CDV抗原来包被固相的检测板，将待检血清稀释不同的倍数然后加入检测板中，再加酶标兔抗犬lgG或IgM，最后加入显色底物并判定结果(Potgietcrcta1．，1989)。ELISA检测的敏感性和特异性分别为95．17％和98．1l，与SN的符合率为97％。VOBMessling等建立了捕获夹心ELISA，该方法是利用杆状病毒重组表达的CDV野生分离株的N蛋白做为包被抗原，可以检测犬血清中的IgG和IgM，该方法可以替代病毒中和试验来用于特异性IgG的定性分析中，因为可以对特异性IgM进行测定，所以可以弥补RT-PCR和病毒中和试验在诊断急性CD方面的不足。5．6ImPCR检测随着分子生物学技术的发展，CDV的诊断也进入了分子生物学阶段。RT-PCR通过特定引物可以对病料中是否含有CDV特异性核酸进行鉴定，该方法准确性高、敏感性和特异性强，尤其在CD早期，对机体特异性免疫抗体无法检测时RT-PCR非常有效(常国权，1995)，同时该方法便于在实验室进行。Yeon-silshin(1997)等应用RT-PCR技术，检测感染CDV犬外周血单核细胞(PBMC)qbCDV的N基因和P基因，对临床CDV感染的病犬有很高的检出率，当幼犬接种疫苗后其检测结果常呈现阴性。李金中等(1999)在国内首次建立了针对CDVOnderstepoort株F基因的RT-PCR诊断方法，该方法准确度高、特异性强、敏感度高，在CDV的临床诊断和实验研究方面均有很大的应用。何洪彬等(1999)针对H全基因序列设计了多条引物来进行RT-PCR，从而获得检测CDV的又一方法。10 犬瘟热病毒的分离、鉴定及单克隆抗体的研制Frisk(1999)等对29只疑似CDV感染犬，采用RT-PCR检测CDV感染，与死后剖检、中和抗体测定及免疫组化检测的结果相比较，发现全血和脑脊髓液样品符合率为88％，血清样品符合率为86％，而免疫组化检测为阴性的犬均未能扩增出CDV特异片段。虽然RT-PCR方法不受病犬病理形式、体液免疫水平及病毒核酸分布的影响，但是受引物序列及RNA提取过程的影响较大但仍不失为一种高特异性和敏感性的诊断方法(Yeon-silshin,1997；李金中等，1999；何洪彬等，1999；Frisketa1．．1999)。国外又有人在RT-PCR的基础上，将巢式PCR应用于CD的诊断上，并且表现出了更高的敏感性。目前，随着分子生物学技术的不断发展，对CDV的研究也越来越深入，更有效，更便捷的诊断方法和治疗产品也不断的被研究出来，同时，新型、高效的疫苗将很快面世，这必将极大的推动我国养犬业的发展。6本研究的目的与意义对于本病预防是关键，目前尚无治疗犬瘟热的特效药物，当病犬出现明显症状时多为预后不良，即使少数耐过也会留下后遗症，所以对本病的早期诊断就显得格外重要，常用的早期诊断方法有ELISA、免疫层析法、免疫荧光抗体技术等，而这些方法的建立均需要单一的抗原或抗体，所以获得单一的犬瘟热病毒可以为很多早期诊断方法的建立奠定基础。此外分离病毒也可以为犬瘟热病毒单克隆抗体的研制准备条件。单克隆抗体技术是目前应用的比较广泛的--fq技术，抗犬瘟热病毒单克隆抗体也是目前的研究热点，首先，犬瘟热病毒单克隆抗体是B淋巴细胞分化为浆细胞所分泌的一类针对CDV的免疫球蛋白，可以和CDV特异性结合，介导体液免疫，在其他免疫分子和细胞的参与下发挥免疫效应，具有一定的治疗价值。其次，ELISA、免疫层析、免疫荧光抗体技术等在检测CD的过程中起到了重要的作用，而这些方法的建立都需要特异性的抗体，研制犬瘟热病毒单克隆抗体可为检测方法的建立提供方便。 华中农业大学2011届硕士学位论文第一章犬瘟热病毒的分离与鉴定CDV对外界环境中光、热，有机溶剂、酸碱等抵抗力非常弱，致使病毒的分离成功率很低。用于病毒分离的原代细胞主要包括：犬肺巨噬细胞、外周血淋巴细胞、鸡胚成纤维细胞等，其中以犬肺巨噬细胞最为易感，分离的成功率最高(Wrighteta1．，1974)，并且可以出现CDV典型的葡萄串状细胞病变，但是犬肺巨噬细胞分离很困难，而且容易污染，鸡胚成纤维细胞也可分离CDV，但是初次分离很困难，病毒需要在鸡胚绒毛尿囊膜上多次传代之后才能在适应鸡胚成纤维细胞。用于病毒分离的传代细胞主要包括：犬肾细胞系(MOCK)、非洲绿猴肾细胞系(Vero)、猫肾细胞系(CREK)、等。根据人们的试验发现Vero细胞是CDV分离培养的首选细胞。本实验选用Vero细胞进行病毒分离培养。1材料1．1病毒来源犬瘟热病毒和犬细小病毒二联弱毒活疫苗(CDVOnderstepoort株和CPV-2a株，英特威公司)，经RT-PCR检测为阳性。1．2细胞非洲绿猴肾细胞系(Vero)fl了本实验室保存；用含有10％新生牛血清的DMEM于3712，5％C02条件培养。犬肾细胞系(MDCK)由本实验室保存；用含有10％新生牛血清的DMEM于37℃，5％C02条件培养。1．3主要溶液配制L．谷氨酰胺(LG)溶液(100X，0．2mol／L)：称取2．929L-谷氨酰胺(L-glutamine，MW146．15)，用100ml不完全培养液或超纯水(或三蒸水)溶解，过滤除菌，分装小瓶(4～5m坍随)，．20"C冻存。青、链霉素(双抗)溶液(100X)：取青霉素G(钠盐)100万单位和链霉素(硫酸盐)lg，溶于100ml灭菌三蒸水或超纯水中，分装小瓶(4--一5ml／瓶)，-20"C冻存。12 犬瘟热病毒的分离、鉴定及单克隆抗体的研制不完全DMEM培养基：DMEM13．379，NaHC033．79，三蒸水980ml，双抗溶液10ml，LG溶液10ml，用1NHCl调试PH至7．2--一7．4，过滤除菌，分装4。C保存。完全DMEM培养基：不完全DMEM培养基90ml，加新生牛血清10ml细胞维持液：不完全DMEM培养基98mL，新生牛血清2mL。细胞消化液(0．2％胰酶，O．02％EDl’A)：准确称取2．Og胰酶，0．29EDTA，0．49KCl，0．069KH2P04，8．09NaCl，0．359NaHC03，O．1329Na2I-IP04．12H20，溶于1000rrd三蒸水中，调pH至7．0～7．4，过滤除菌后，分装，．20℃保存。1．4主要试剂蛋白酶K、琼脂糖、琼脂粉和DNAMarkerDL2000购自北京全式金公司十二烷基硫酸钠(SDS)、7．--胺四乙酸钠(EDTA)购自武汉亚法生物工程公司DNA分子量Marker、dNTPs购自TaKaRa公司TaqDNA聚合酶、反转录酶购自武汉杰洋盛公司总RNA提取试剂盒购自大连宝生生物公司PCR引物由北京鼎国生物公司合成DMEM、购自GIBCO公司新生牛血清，杭州四季青公司兔抗犬细小病毒高免血清，哈尔滨军事兽医研究所L．谷氨酰胺(LG)购自Fluka公司其它有关试剂为国产分析纯试剂1．5主要仪器及耗材高速冷冻离心机，Sigma公司高速微量离心机，德国eppendorf公司超速离心机，美国Backman公司PCR仪，东盛公司光学倒置显微镜，日本Olympus公司超低温冰箱，Haier公司三蒸水系统，上海亚荣生化仪器厂移液枪，Finnpipette公司13 华中农业大学2011届硕士学位论文超净台，哈尔滨东联仪器厂WD．9403D紫外分析仪、DYY-6C稳压稳流电泳仪，北京六一仪器厂恒温水浴仪、电热恒温鼓风干燥箱和摇床，上海精宏实验设备有限公司玻璃细胞培养瓶，武汉迪跃生物公司96孔细胞培养板、细胞冻存管，Costar公司2试验方法2．1样品的处理及病毒分离培养取冻干犬瘟热二联弱毒苗(英特威公司生产)，加入lmL的灭菌三蒸水，冻融一次，4"C静置2小时，从中间取出0．5mL按0．5mL剂量加入双抗溶液。按1／5量加入兔抗犬细小病毒高免血清在4"C作用1小时，用微型滤器(孔径0．22ram)过滤，取滤液。取70"-80％的Vero单层细胞，弃掉培养基，并用PBS液洗后接种过滤后的病毒，37"(2吸附-d,时后，换成无血清的DMEM维持液与37。C，5％C02条件下培养，观察细胞病变，同时设立正常对照组，对于未出现病变的细胞盲传三代观察。当细胞病变达80％以上时收毒，-20"C保存。2．2病变样品的RT-PCR检测2．2．1引物的设计和合成．根据CDVOnderstepoort弱毒株F基因的相对保守区域序列和设计引物的一般原则设计引物，RT-PCR扩增片段大小为574bp，该引物由北京鼎国生物公司合成。P1：5'-TTAGTTGGGCAGAGATTAG-3’P2：5'-GCGACGAD蛆'1．ACCTmG-3’2．2．2RNA的提取参照大连宝生生物公司总RNA抽提试剂盒进行，具体操作方法如下：(1)取100pL病毒液体加入到1．5mL微量离心管中，再加入900pL的Ls．biotragnets，剧烈震摇15s，室温静置5min。(2)加入200I．tL氯仿，剧烈震摇15s，室温静置15min，12000Xg4"0离心15rain。(3)小心吸取上清液(水相)并记录体积转移至新的EP管中，加入与上清液14 犬瘟热病毒的分离、鉴定及单克隆抗体的研制等体积的异丙醇(O．6mL／1．0mLT魁z01)，上下颠倒混匀，室温静置10min以沉淀总RNA，12000xg4"C离心10min，小心吸出上清液，以防止沉淀丢失。(4)沿管壁缓慢加如75％乙醇1．0mL，7500xg4"C离心5min，弃上清，用枪头去除管底残留的液滴，室温自燃干燥(不用完全风干，防止降低其溶解性)。(5)加20此DEPC水溶解，用枪头缓慢吹打5、6次至溶解混匀，所得溶液可进一步纯化或者．80℃保存。2．2．3反转录对提取的病毒RNA进行反转录，获得eDNA用于PCR扩增，反转录体系(209L)如表1．1表1-1．反转录体系试剂体积反转录产物放．70℃保存，备用。2．2．4PCR扩增取反转录产物，用合成的CDV引物进行PCR扩增，扩增体系(25此)如表1．2表1—2．PCR体系Thbl．2．PCRsystem试剂体积模板2．5止dNTP2肚P11皿P21此Taq酶0．20I．10Xbuffer2．5止DEPC水15．89LPCR反应条件：94℃3min，94℃lmin，53℃50s，72℃50s，72℃10min，30个循环。15 华中农业大学201I届硕士学位论文2．2．5琼脂糖凝胶电泳PCR产物31aL，加6×Loadingbuffer2ttL混匀，1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为0．5xTBE，恒压100V，20min后分析。2．3细小病毒的PCR检查2．3．1引物的设计和合成根据CPV-2a基因组VP2基因核酸序列和设计引物的一般原则设计引物，PCR扩增片段大小为650bp，该引物由北京鼎国生物公司合成。P1：5’．GAAGAGTGGTTGTAAArAA兀．3’P2：5’．CCT≮彤dAACCAAAGl-I’AGTAC．3’。2．3．2病变细胞DNA的提取将收毒后的细胞冻融三次后，用1．5mL的微量离心管取病毒液500mL，加入10％的SDS使终浓度为1％，加入蛋白酶K使终浓度为500pg／mL，50"C，水浴2小时后，加入等体积的苯酚、氯仿混合液(苯酚：氯仿=1：1)，震荡混匀，室温静置10min，12000r／min离心10min，小心移取上清液至另一1．5mL的微量离心管中，再加入等体积的苯酚、氯仿、异戊醇混合液(苯酚：氯仿：异戊醇=)，震荡混匀，室温静置10min，12000r／min离心10rain，小心移取上清液至另一1．5mL的微量离心管中，再加入2倍体积的无水乙醇，．20"C放置2小时，12000r／rain离心20min，吸干液体，沉淀自然晾干，用15此的超纯水溶解DNA，．20"C保存。2-3．3PCR扩增取提取的DNA，用合成的CPV-2a引物进行PCR扩增，扩增体系(259L)如表1—3表l-3．PCR体系Thb1-3．PCRsystem堕型：堕塑模板3此dNTP2vLPll皿P21皿Taq酶0．SttL10Xbufffer2．5止DEPC水15此PCR反应条件：96℃3min，96℃30s，52℃30s，72℃60s，72℃10min，30个16 犬瘟热病毒的分离、鉴定及单克隆抗体的研制循环。2．3．4琼脂糖凝胶电泳PCR产物3此，加6xLoadingbuffer2此混匀，1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为0．5xTBE，恒压100V，20min后分析。2．4血凝试验‘2．4．1红细胞悬液的制备分别采集健康猪、鸡、兔和绵羊的血液与等体积阿氏液混合，用pH7．2的0．01moFLPBS液洗涤3次，每次均以1000r／min4"C离,L,10min，洗涤后用PBS配成1％(VⅣ)红细胞悬液，4℃保存备用。2．4．2血凝实验将纯化、浓缩后的病毒用PBS做1：10、1：20、l：40、1：80、1：160、1：320和l：640倍的倍比稀释，分别吸取50lIL滴加到96孔V型反应板中，然后加入等量的体积分数为1％的猪红细胞悬液，于微型振荡器上振荡混匀约lmin，再于4"0和37℃，分别作用静置30,-一60min后观察记录，并做对照孔。按照同样的方法，观察对鸡、兔及绵羊红细胞的血凝性。2．5组织培养半数感染量(TCID50)测定在96孔板上用含有10％新生牛血清的DMEM培养Vero细胞，待细胞长满单层后吸出培养基，用PBS清洗，接入CDV病毒液，病毒液采用lO被倍比稀释，每孔加入100pL，37．0吸附1h后吸出病毒液补足维持液，每一稀释度加10孔，同时设两孑L细胞滴加等量维持液作为对照。置于37．0，5％C02培养，每天观察记录生长情况，直至终点，用Reed-Muech统计法计算分离病毒的TCID50。2．6病毒理化试验将分离得到的CDV接种Vero细胞，37"(2，5％C02条件下培养，当CPE达80％以上时收获病毒，取收获的病毒冻融三次，12000r／min，4"0，离心15min，取上清于．20．0保存，用于病毒理化试验。2．6．1病毒囊膜试验取lmL病毒液，加入0．4mL氯仿，充分震荡混匀，于4℃静置20min，12000r／min，17 华中农业大学201l届硕士学位论文4℃，离心10min，吸取上层液体接种Vero细胞，37"(2，5％C02培养观察细胞病变。同时设对照组，每lmL病毒液加入0．4rid的DMEM，其他条件相同。2．6．2病毒核酸型试验试验原理：溴脱氧尿嘧啶核苷(BfDU)溶液是DNA前提胸腺嘧啶核苷类似物，可竞争性掺入DNA合成期(S期)细胞内单链DNA核苷酸序列中替代胸腺嘧啶，造成对DNA病毒转录、翻译的抑制，而对RNA病毒则无影响。试验方法：将消化好的Vem细胞用96孔板培养，当细胞长满80％时吸出培养基，加入病毒液(100pL／孔)吸附两个小时后吸出病毒液，每孔加入BrDU(1ug／mL)20}tL，补足培养基，对照组只加相同浓度的BrDU和培养基不加病毒，37℃，5％C02培养，逐日观察细胞病变。2．6．3病毒酸碱敏感试验耐酸性试验：用0．1MHCL将病毒液的pH调至4．0，4"C作用2h，用5．6％NaHC03将病毒液的pH调回7．0左右，用PBS将病毒液作10倍梯度倍比稀释至10‘3，每孔1001咀L接种到新长满单层Vero细胞的96孔板，37"C，5C02培养，测病毒的TCIDso／mL，感染力下降2个对数以上者为不耐酸。耐碱性试验：用5．6％NaI-IC03将病毒液的pH调至10．0，4"C作用2h，再用0．1MHCL将病毒液pH调回7．0左右，其余操作与判定标准同上。确定病毒的耐碱特性。2．6．4病毒温度敏感-I生试验取待测的CDV病毒液于60"C作用1h，用PBS将病毒液作10倍梯度倍比稀释至10《，每孔100pL接种到新长满单层Vero细胞的96孔板，37"C，5C02培养，测病毒的TCID50／mL，感染力下降2个对数以上者位不耐酸。3实验结果3．1分离病毒感染Vero细胞产生的细胞病变本试验用正常的Vero细胞作为对照，对照组细胞排列整齐、紧密，细胞形态结构规则、清晰。Vero细胞在接种CDV后置37"(2，5％C02下培养逐日观察，约第5天开始出现CPE，表现为细胞变圆，胞质内颗粒增多，折光性增强，第6"-'7天胞浆空泡化，第9～11天部分细胞坏死脱落，呈现拉网状等现象。18 犬瘟热病毒的分离、鉴定及单克隆抗体的研制正常Vero细胞NormalVerocell接毒后的Vero细胞TheVerocellinfectedbyCDV图．1．1Vero细胞接种CDV病变结果Fig．1—1TheCPEofCDVinVerocell3．2CDV的ImPCR检测提取CDV的RNA反转录为eDNA，应用CDV特异性引物对所得到的eDNA进行PCR扩增，结果扩增出与预期片段574bp相符的核酸条带(图1．2)，判断CDV在Vero细胞上生长，并引起了细胞的病变。1000—750—．500—+250．．一100—M1234图1-2．CDV的RT-PCR检测结果Fig1-2．IdentificationofCDVbyRT-PCRM：DNALadder(DL2000)；1、2、3：AmplifiedproductofPCR；4：PCRNegativecontrol3．3细小病毒的PCR检测提取提取病变细胞的DNA，应用合成的CPV-2a引物对获得的DNA进行PCR扩增，同时用CPV-2a的DNA做阳性对照，由电泳图谱(图1．3)分析可知，病变细胞中无犬细小病毒的存在。19 华中农业大学201l届硕士学位论文2000—1000—750—500—250—100—M123650图1-3．CPV-2a的PCR检测结果Fig1-3．IdentificationofCPV-2abyPCRM：DNALadder(DL2000)；1：PCRPositivecontrol；2、3：AmplifiedproductofPCR3．4血凝试验“V”型血凝板中l：10～1：640各稀释度的CDV病毒液与猪、鸡、兔及绵羊红细胞在4。C及37。C分别作用30～60min后，红细胞均沉于孔底，呈圆点状，未出现血凝现象，说明CDV对猪、鸡、兔及绵羊红细胞没有血凝性。如图表1-4表1-4．CDV分离株血凝实验结果Tablel．4．ResultsofHAtest注：“撑”、“卅”、“++”“+”和“．”表示血凝程度，即分别相当于100％、75％、50％、25％凝集和不凝集。3．5病毒TCID50采用TCID50检测CDV对Veto细胞的毒力，其试验结果见表1．520 犬瘟热病毒的分离、鉴定及单克隆抗体的研制表1-5．CDV的细胞半数感染量(TCID如)Tablel-5．TheresultoftheCDVincelltoxicitytest正常对照细胞未见任何病变。比距=(高于50％的百分数．50)／(高于50％的百分数．低于50％的百分数)=(60—50)／(60．20)=O．2550％稀释指数=比距×(下限指数．上限指数)+上限指数---6．25通过Reed．Muech统计法计算可知，CDV的TCID50=10-6．25／mL。即将病毒液稀释10巧笛倍后，取lmL接种细胞，可引起半数以上的单层Vero细胞感染。3．6病毒的理化试验3．6．1病毒囊膜试验用氯仿处理CDV，作用20min后接种Vero细胞，逐日观察至第10d，细胞没有出现特征性的病变过程，对照组CDV没经过氯仿处理，接种Vero细胞，相同条件下可见到特征性的细胞病变过程。所以推断CDV为有囊膜病毒，氯仿处理可让其失去活性。3．6．2病毒核酸型试验实验组细胞在4～5d细胞开始出现病变，第6～8d细胞开始大量拉网脱落；对照组细胞用相同浓度的BrDU处理，形态稍微有些改变，但没有出现渐进性的病变过程，细胞能够正常的生长。因此可以推断分离的CDV为RNA病毒。 华中农业大学2011届硕士学位论文3．6．3病毒酸碱敏感试验通过试验测得病毒在pH4．0时，其TCID50为10n5，病毒在pill0．0时，其TCID50为10艺一，所以病毒对酸碱环境敏感，过酸和过碱都会使病毒的活性降低。3．6．4温度敏感性试验CDV病毒液经56"C，30min处理后10-l"-'10。6各稀释度所接种的细胞，逐日观察至10d，均未见到细胞出现特征性的病变过程，所以推断CDV对温度非常敏感，56℃，30rain就可使CDV失去活性。4讨论犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的犬及其它食肉动物的一种具有高度接触性的传染病，具有发病急、死亡率高等特点；对我国的养犬业及野生动物造成严重的威胁。所以对犬瘟热的早期诊断工作是本病治疗的关键，犬瘟热病毒的分离是很多诊断方法建立的基础。CPV分离培养不同于一般的病毒分离，成功率很低，主要是因为病毒对环境的抵抗力很低，光、热、有机溶剂、过酸和过碱都会使病毒很快失活，这给病毒的分离带来了很大的困难。据文献报道(GemmaTWTeta1．，1996)，病毒可以在多种原代和传代细胞上生长，原代细胞主要包括：犬肺巨噬细胞、鸡胚成纤维细胞等，其中以犬肺巨噬细胞最为易感，分离的成功率最高，病毒感染犬肺巨噬细胞可以出现CDV典型的葡萄串状细胞病变，但是犬肺巨噬细胞分离很困难，而且容易污染，鸡胚成纤维细胞也可分离CDV，但是初次分离很困难，病毒需要在鸡胚绒毛尿囊膜上多次传代之后才能在适应级配成纤维细胞。所以考虑用传代细胞来分离CDV，据文献报道，病毒可以在Vero细胞上生长，并且能够产生明显的细胞病变。所以本实验选择用Vero细胞来分离病毒，并成功分离出一株CDV病毒株。本实验选择用犬瘟热二联弱毒疫苗来分离CDV，在病毒分离过程中做到了以下几点是这次分离成功的关键：1疫苗放4。C保存，存放时间不宜过长。2因为小牛血清中含有干扰病毒吸附的因子，分离病毒时选择用长满60"--70％的Veto细胞，弃掉培养基，并用PBS洗两次后接种病毒，将孵育时间延长到2小时。3因为Vero细胞生长过快观察不到CPE过程，所以维持液用含有2％小牛血清的DMEM。在对分离病毒进行RT-PCR检测时，病毒RNA的提取是RT-PCR检测成功的前 犬瘟熟病毒的分离、鉴定及单克隆抗体的研制提，因为RNA极易污染、降解，所以RNA提取要求非常严格。本试验中选用大连宝生生物公司的总RNA提取试剂盒，在提取过程中，严格按照操作规范，避免RNA的污染和降解，最终提出病变细胞的总RNA，采用常规方法反转录为cDNA后，用犬瘟热病毒特异性引物进行PCR扩增，结果显示阳性，血凝实验结果显示，病毒不凝集猪、鸡、兔及绵羊的红细胞，符合报道CDV的特性。在病毒的理化试验中，病毒可以被氯仿灭活，说明病毒有囊膜，56℃30rain即可使CDV失活，可知CDV对温度敏感，pH4．0以下和pH10．0以上病毒活力均受到一定影响，说明CDV对酸碱环境有一定抵抗力，但过酸过碱不利于病毒的生长。通过病毒的理化试验可知，病毒对环境的抵抗力差，这也进一步解释了CDV分离困难的原因。本实验中分离的是CDV的Onderstepoort株，该毒株是犬瘟热弱毒苗的主要毒株。通过检测，病毒的TCID50为10-6-25／ml，现在分离的野毒株的TCID50为10嘞【Ill～lO'6／ml，这表明CDVOnderstepoort株对Vero细胞的亲嗜性教强，产生病变明显，所以CDVOnderstepoort株适合用Vero细胞来扩大培养。 华中农业大学2011届硕士学位论文第二章抗犬瘟热病毒单克隆抗体的制备目前，犬瘟热已在我国广泛流行，成为犬的一种急性烈性传染病，严重影响了我国的养犬业。为了诊断和防治犬瘟热，国内外已开展了大量研究工作。目前常用的诊断方法有病毒分离培养、电镜检查、包涵体检测、FA、ELISA、和RT-PCR等，其中FA技术具有特异性强和快速高效的特点，是目前国际通用诊断CD手段。ELISA、RT-PCR方法操作繁琐。以上方法不适用于基层推广应用。而应用CDVMcAb研制CDV胶体金诊断试剂条具有简便、快速、特异、易行的优点，对提高临床诊断水平具有重大意义。对于CDV的治疗应尽早进行，因为后期的治愈率很低，治疗多采用补液、抗菌、防止继发感染，有报道称采用CDVMcAb和抗犬瘟热病毒高免血清并配合抗病毒药物对犬瘟热的早期治疗效果显著，所以对CDVMcAb的研制具有重要的意义。1材料1．1细胞系和病毒株小鼠骨髓瘤细胞SP2／0和非洲绿猴肾细胞系(Vero)由本实验室保存；CDVOnderstepoort株，CPV-2a，CAVII均由本实验室分离保存。1．2常用溶液配制不完全DMEM培养基：DMEM13．379，NaHC033．79，三蒸水980mL，LG溶液10mL，双抗溶液10mL，用1mol／LHCl调试PH至7．2"--7．4，过滤除菌，分装4"0保存。完全DMEM培养基：不完全DMEM培养基90mL，加新生牛血清10mLHAT培养基：完全DMEM培养基98mL，A贮存液lmL，HT贮存液lmL氨基喋呤(A)贮存液(100×，4X10～moFL)称取1．76rag氨基喋呤(AminopterinMW440．4)，溶于90mL三蒸水中，滴加1mol／LNaOH0．5mL中和，再补加三蒸水至100mL。过滤除菌，分装(2mF瓶)，．20℃保存。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)贮存液(100x，H：lxl0。2moFL，T：1．6x10一moFL)：称取136．1mg次黄嘌呤(Hypoxanthine，MW136．1)和38．8mg胸腺嘧啶核苷 犬瘟热病毒的分离、鉴定及单克隆抗体的研制(Thymidine，MW242．2)，加三蒸水至100mL，置45～50"C水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶(2ml／瓶)，-20"C冻存。用前可置37℃加温助溶。1．3动物SPF级BALB／c雌性小鼠(6"--8周龄、体重15"--209：8"-_，10周龄、体重209以上)，购自湖北省疾病控制中心。1．4主要试剂DMEM培养基，GIBCO公司；新生牛血清，杭州四季青公司弗氏完全佐剂和不完全佐剂、二甲基亚砜(DMSO)、羊抗鼠辣根过氧化物酶标记IgG及IgM、羊抗鼠FITC标记的荧光二抗、鼠源单克隆抗体亚类鉴定试剂盒均为Sigma公司产品次黄嘌呤(H)、胸腺嘧啶核苷(T)、L．谷氨酞胺(LG)，Fluka公司氨基喋呤(A)，Gibco公司融合用PEGl500，Roche公司TMB显色液，北京鼎国生物技术公司其它有关试剂为国产分析纯试剂。1．6主要仪器及耗材高速冷冻离心机，Sigma公司高速微量离心机，德国eppendorf公司超速离心机，美国Backman公司光学倒置显微镜，日本Olympus公司超低温冰箱，Haier公司移液枪，Finnpipette公司超净台，哈尔滨东联仪器厂96孔细胞培养板、酶标板、细胞冻存管，Costar公司 华中农业大学201l届硕士学位论文2方法2．1抗原的制备用PEG沉淀法提纯浓缩犬瘟热病毒，将收获的病毒液冻融三次，4‘C，3000r／rain，离心30rain，收集上清液，加入PEG6000使其终浓度为8％，加入NaCl至终浓度为0．3M，混匀后，4"C静置过夜，8000r／min，离心30min，收集病毒沉淀，加入20MPBS，4"C静置过夜，10000r／min离心lh，收集病毒沉淀，用2mL的PBS溶解，测其浓度后，．80℃保存备用。2．2动物免疫将浓缩后的CDV抗原稀释成浓度为100pg／mL，选取5只6周龄左右雌性BALB／c小鼠，第一次免疫时，将抗原与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，采用皮下多点注射，剂量0．2mL／只；第二次免疫在2,--,3周后进行，免疫前先将抗原与等量弗氏不完全佐剂充分乳化，皮下多点注射，O．2mⅣ只；第三次免疫在两周后进行，免疫方法和剂量与第二次免疫相同。一周以后，眼眶采血测血清抗体效价，选择效价最高的两只小鼠，一周以后用不加佐剂的抗原尾静脉注射加强免疫，剂量O．1mL／只，3d后取小鼠脾细胞与SP2／0细胞融合。2．3融合2．3．1骨髓瘤细胞的准备融合前两周开始复苏骨筒瘤细胞SP2／0，扩大培养，融合时确保SP2／0处于对数生长期，有良好的形态，活细胞计数高于95％；融合当天，用DMEM不完全培养基将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50mL离心管内，1000r／min离心10min，弃去上清，加入30mLDMEM不完全培养基，同法离心洗涤一次；然后将细胞重悬于10mLDMEM不完全培养基中，混匀，制成细胞悬液。2．3．2脾淋巴细胞的准备取加强免疫后3d的雌性BALB／c小鼠，摘除眼球采血作为阳性血清；颈椎脱臼致死小鼠，浸泡于75％酒精消毒其体表10rain，随即放入超净台内的解剖板上，腹部朝上，四肢固定；无菌取出脾脏，用无血清DMEM洗涤数次，并用镊子除去附着的结缔组织。脾脏移入200目微孔滤网上于新鲜DMEM中，用研磨棒轻轻研 犬瘟热病毒的分离、鉴定及单克隆抗体的研制磨，将脾脏制成单细胞悬液，并移至10mL离心管中，置37℃的5％C02细胞培养箱中自然沉降10～15mill，吸取上清中的细胞悬液，弃去肉眼可见组织或团块。2．3．3饲养细胞的准备将BALB／c小鼠摘除眼球采血，分离血清，作为抗体检测时的阴性对照血清；同时通过颈脱位致死小鼠，于75％酒精中浸泡10min，腹部向上固定后，无菌剪开腹部皮肤，镊子剥离皮肤，暴露腹膜，酒精棉球擦拭腹膜消毒；用注射器注射10mLHAT完全培养基至腹腔，注意不要穿入肠管，左手固定注射器，将针头留置在腹腔内，右手持酒精棉球轻轻按摩腹部lmin，反复抽吸注入的培养液后吸出培养液；1000r／min离心10rain，弃上清；用5mLHAT完全培养基重悬沉淀细胞，调整细胞浓度至2x105个／mL：将上述细胞悬液加入96孔板，每孔一滴(约50此)，然后置37℃、5％C02培养箱中培养。2．3．4细胞融合按常规方法融合，取计数后的SP2／0细胞与脾淋巴细胞按1：5"-'1：10的比例混合于50mL离心管中，充分混匀。1000r／min离心10min，弃上清。用手掌轻击离心瓶底，使沉淀的细胞打散。将离心瓶底部放入40"-41℃水浴中，边旋转边加入融合用的PEGlmL，在lmin内加完，继续旋转同时加入无血清DMEM15mL，在90s内加完，由慢到快，前5s加lmL。室温静置10rain后，1000r／min离心10min，弃上清，将HAT选择培养液加入到细胞融合物中，悬浮细胞，分配到已有饲养细胞的96孔细胞培养板，置于37℃、5％C02的温箱中培养；5d后用新鲜预热的HAT培养基换出一半培养基；10d后用预热的HT换出HAT；观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1／10以上时，吸取适量细胞上清进行抗体检测。2．4最佳抗原包被浓度和抗体稀释度的确定融合前免疫小鼠眼球采血制备的阳性血清，筛选时作为阳性对照；非免疫小鼠眼球采血制备的血清作为阴性对照，同时以PBST作为空白对照调零孔。在酶标板上进行方阵试验，确定检测抗原的最佳包被浓度及阳性、阴性对照的最佳稀释浓度。具体步骤为：检测抗原(CDV全病毒液)从10099／mL开始，横向用0．05mol／L碳酸盐包被缓冲液(pH9．6)2X、4×、8X、16×、32X、64×稀释，100肛l／孔包被27 华中农业大学2011届硕士学位论文ELISA板，37"C作用2h后置4*0过夜，弃去孔内的液体，PBST洗涤液洗3次，每次5min，拍干；150itL／孔封闭液37"C作用2h，PBST同前洗涤拍干，一抗(阳性血清)纵向以PBST进行100x、200x、400x、800x、1600x、3200x稀释，100刖孔，37"C作用1h，同前洗涤拍干；加入工作浓度(1：3000稀释)的羊抗鼠HRP-IgG／IgM，100ttL／孔，37*(2孵育1h，同前洗涤拍干；加入TMB底物显色液100rtL／孔，37℃反应10"-'15min；加入2MH2S0450pL／孔终止反应。测定孔内的OD450。结果判定：以阴性值小于0．2，P／N值最大时的抗原浓度为抗原最佳工作浓度，该点所对应的血清稀释度为最佳血清稀释度。2．5检测板的准备用碳酸盐缓冲液稀释抗原至方阵试验确定的包被浓度，包被96孔聚苯乙烯酶标板，100p,L，孔，37"C作用2h后置4。C过夜后用PBST洗3次，每次5min，拍干，每孔加入150ttL封闭液进行封闭，37℃水浴作用2h后同前洗涤，拍干，-20"C保存、备用。2．6杂交瘤细胞的检测及筛选采用间接ELISA方法来筛选阳性克隆。融合10d换液后，待杂交瘤细胞生长至培养孔1／10或者培养上清变黄时，吸取待检孔上清100pL加入上述检测板孔中，同时设立阳性、阴性和空白对照，37℃孵育1h，同前洗涤拍干；加入工作浓度(1-3000稀释)的羊抗鼠HRP-IgG／IgM，1009L／孔，37℃孵育lh，同前洗涤拍干；加入TMB底物显色液1009L／孔，37"C反应10"'15mill；加入2MH2S0450刖孔终止反应。测定孔内的OD450。判断标准：待检孔的OD值／阴性孔的OD值／>2．1即可判为阳性，可进行下一步试验。2．7阳性杂交瘤细胞的亚克隆采用有限稀释法对连续两次检测为阳性的细胞株进行克隆化：克隆前制备小鼠饲养细胞层：首先将待克隆孔活细胞做准确计数，用HT培养基10倍比稀释成20个细舢培养基，加入到已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，使每孔理论上有1个细胞，置于37"(2、5％C02的温箱中培养。当细胞生长至孔底面积的1／10时进行检测，强阳性孔再克隆，如此重复3"-4次，直至阳性率达到100％。然后将克隆化的杂交瘤细胞扩大培养，冻存细胞，同时保留上清液待测。并进行连续传代培28 犬瘟热病毒的分离、鉴定及单克隆抗体的研制养、液氮冻存与复苏实验，用间接ELISA连续检测杂交瘤细胞培养上清液中的抗体效价。2．8腹水的制备选8一-10周龄体重209以上的雌性BALB／e鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡，0．5mI／只；1周后腹腔注射杂交瘤细胞(2×106～5X106细胞／只)，在动物腹部明显增大时用16号针头从腹腔采集腹水，3000r／min离心10min，取上清液，测定效价后．80℃冻存备用。2．9单抗特性的鉴定2．9．1单抗效价测定采用间接ELISA的方法，将培养液上清和腹水倍比稀释，其中培养液上清采用2倍倍比稀释，腹水先按1：100稀释，再按2倍倍比稀释，依次加入包被抗原的酶标孔内，其他步骤同2．4。2．9．2单抗特异性鉴定犬瘟热病毒(CDV)、取犬细小病毒