山东地区Ⅰ型鸭肝炎病毒分离鉴定及单克隆抗体的研制.pdf

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1、动物医学进展。2012，33(2)：63—66ProgressinVeterinaryMedicine山东地区I型鸭肝炎病毒分离鉴定及单克隆抗体的研制提金凤，李志杰，李舫(山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊261061)摘要：用SPF鸡胚从临床上疑似鸭病毒性肝炎(DVH)的商品肉仔鸭肝脏中分离得到一株病毒。该病毒能在96h内致死鸡胚，48h内致死鸭胚，死胚尿囊液无血凝性。RT—PCR和血清中和试验的结果表明，该病毒为I型DHV。用该病毒免疫Balb／c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2／O进行融合，以浓缩提纯后的该病毒为筛选抗

2、原，通过间接ELISA法对杂交瘤进行筛选，经亚克隆后获得一株针对I型DHV的特异性单克隆抗体，并对该株单克隆抗体的特性进行了鉴定。关键词：工型鸭肝炎病毒；分离鉴定；杂交瘤；单克隆抗体中图分类号：$852．659．6；$858．32文献标识码：A文章编号：1007—5038(2012)02—0063—04鸭病毒性肝炎(Duckviralhepatitis，DVH)是小鼠骨髓瘤细胞SP2／O—Ag14由中国动物卫生与流由鸭肝炎病毒(Duckhepatitisvirus，DHV)引起的行病学中心邵卫星博士馈赠。一种传播快速、急性高度致死

3、性传染病，主要侵害11．1．2主要试剂PEG4000、高糖型DMEM、次月龄以内的雏鸭。该病于1949年由Levine和Ho{-黄嘌呤、胸腺嘧啶、L一谷氨酰胺、单克隆抗体亚类鉴stad首次发现于美国的长岛，呈世界性分布，是危害定试剂盒、邻苯二胺(OPD)、辣根过氧化物酶养鸭业最为严重的传染病之一_】]。鸭病毒性肝炎的(HRP)为Sigma公司产品；羊抗鼠IgG—HRP、羊抗病原为DHV，可分为3个血清型，分别为工型鼠IgGM—HRP为华美公司产品；氨基喋呤为GIB—DHV、Ⅱ型DHV和Ⅲ型DHV]。DHV属于小C0BRL公司产品。

4、RNA病毒科，病毒粒子呈正二十面体结构，其组成1．2方法为衣壳蛋白和一条由衣壳蛋白包裹的长约7．7kb1．2．1病毒的分离培养从山东地区某鸭场(临左右的单链正股RNA组成。I型DHV流行最广床诊断为鸭病毒性肝炎)采集发病鸭的肝脏，在匀浆泛且致病力最强，Ⅱ型DHV仅见于英国，Ⅲ型器中加入适量灭菌的生理盐水(一般按照1：4的比DHV仅见于美国和中国，均呈偶发性[3]。例)后进行匀浆，组织液12000r／min10min离心，近年来，国内外也相继有关新型DHV(N—取上清液，加入青霉素和链霉素在4℃过夜。然后DHV)的报道，但I型DHV

5、仍是发病的主要血清将上清液经尿囊腔接种9日龄～l1日龄的SPF鸡型。传统上对该病的治疗是采用卵黄抗体，但有时胚10枚，0．2mL／枚，另设生理盐水对照。37℃温受卵黄抗体中非特异性蛋白或抗体滴度过低的影箱中培养，观察5d～8d，并收集死亡胚的尿囊响，治疗效果较差。针对这种情况，本文从山东地区液嘲。分离出一株I型DHV并进行鉴定，然后对其进行单克隆抗体的研制，筛选出具有中和性的单克隆抗1．2．2病毒的鉴定。]体，为以后进一步用单抗来进行该病的临床诊断和1．2．2．1病毒中和试验按照文献[2]进行。用治疗提供方法。灭菌生理盐水稀释收集

6、获得的疑似DHV尿囊液，1材料与方法稀释至0．2mL病毒含量为200ELD取0．2mL1．1材料与等量的工型鸭肝炎病毒的阳性血清进行混合，1．1．1鸡胚、细胞系及实验动物SPF鸡胚购白37℃水浴作用30min，然后接种1O枚SPF鸡胚，每山东省农科院家禽研究所；6周龄的Balb／c小鼠以只胚0．2mL，37。C温箱培养，观察5d～8d。及8周龄～1O周龄的昆明鼠购自山东大学医学院；1．2．2．2动物回归试验将10只3日龄鸭肝炎病收稿日期：2011-10—13作者简介：提金凤(1977一)，女，山东莱州人，讲师，硕士研究生，主要从事

7、动物传染病及免疫学研究。*通讯作者64动物医学进展2012年第33卷第2期(总第224期)毒母源抗体阴性的雏鸭分为2组，5只／组。其中1原介导的ELISA法(Atigen—MediatedELISA)，按组用获得的疑似DHV尿囊液及死亡胚体的混合其说明书所介绍的方法进行测定。物，颈部皮下注射进行攻毒，攻毒量为0．5mL／只；1．2．4．2效价测定取已定株的杂交瘤细胞株的另1组设为对照组，颈部皮下注射生理盐水，培养上清和其腹水做倍比稀释，问接ELISA进行0．5mL／只。隔离饲养，观察并记录结果。测定。1．2．2．3RT—PCR鉴定

8、按照文献[8—9]进行。参1．2．4．3单克隆抗体特异性鉴定用鸡胚尿囊考GenBank中已发布的血清型工型DHVVP1基液、DPV、EDS一76V、IBV、MDV及NDV等抗原点因序列，由宝生物工程(大连)有限公司合成引物。样，用Dot—ELISA