鸭病毒性肝炎病毒的分离与鉴定.pdf

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1、山东畜牧兽医2014年第35卷鸭病毒性肝炎病毒的分离与鉴定冯永胜衣服德(山东省青岛市畜牧兽医研究所266100)陈正平(青岛市崂山区沙子口街道畜牧兽医站)中图分类号：$858．32文献标识码：B文章编号：1007-1733(2014)06-0054-02鸭病毒性肝炎(DVH)是由鸭肝炎病毒(DHV)引起雏鸭按Reed．Muench法计算ELD50。的一种以肝脏出血性炎症为特征的急性烈性传染病。该1．7动物回归试验选择50只4日龄雏鸭，随机分为5病在许多国家广泛传播，使养鸭业遭受重大损失。近年组，每组10只。将病料接种雏鸭，腿部肌肉注射

2、，O．2ml／来，在许多地区时有发生，严重影响了养鸭业的发展。只。对照组雏鸭注射相同剂量的生理盐水。观察并记录为了有效控制该病的发生和流行，笔者从患病鸭群中分雏鸭的临床表现和死亡情况。离了DHV分离株，并进行了初步的鉴定。2结果1材料与方法2．1病毒分离病料接种在l1～12日龄鸭胚传5代后，基1．1材料DHVI型标准阳性血清购自中国兽医药品监察本稳定在48～96h胚胎死亡，死亡率可达90％以上(鸭胚传所：9-11曰龄SPF鸡胚购山东省家禽研究所；11～12日龄代死亡情况见表1)。死亡鸭胚发育受阻，全身皮肤和皮非免疫鸭胚购自潍坊某孵化场

3、；4日龄雏鸭购自潍坊某种下充血和出血，腹部和后肢严重水肿，肝呈黄红色，肿鸭场。大，并有针头大小出血点和坏死灶。该病毒株对鸭胚1．2病料的采集将DVH病鸭无菌采集肝脏。接种普通ELD50按照毒力测定方法测定结果为10。琼脂平板、麦康凯琼脂平板，分别在37℃恒温箱培养表1DHV分离株各代次鸭胚不同死亡时间的死亡率24h。观察有无细菌生长。将病料研碎，与灭菌生理盐水代鸭胚堕墅圭堕48-96h总死次数(枚)25-4849~72739697120121168死亡率亡率按照l：5混匀，然后加入终浓度为1000U／ml的青霉素和链Fl2O65405

4、5％8O％霉素，于4。C冰箱中过夜。3000fmin离心10min，取上清F219773073％89．5％液，．2O℃保存备用。2O870275％85％1．3病毒的分离与培养将病料上清液经尿囊腔接种Fd18781083％88．9％F520【180095％95％11-12日龄非免疫鸭胚各20只(0．2ml／枚)，于37．5℃温箱内培养。弃去24h内死亡的鸭胚，以后每隔12h观察1次，收2．2R1PCR检测结果DVH病鸭肝脏中提取RNA，采用RT-PCR方法扩增出O．5kbp大小的片段，与预期大小一集死亡鸭胚的尿囊液，观察鸭胚病变。按同样

5、的方法，致。采用RT-PCR方法检测鸭胚尿囊液中是否有禽呼肠孤将病毒连续盲传5代。病毒、禽淋巴细胞白血病病毒等，结果均为阴性。接种1．4RT-PCR检测参照GenBank中发表的DHVVP1基因鸡胚比正常鸡胚小，孵至21日龄后仍不能出壳而出现死序列设计1对引物，引物由上海捷瑞公司合成。按照胚。所分离的病毒不能凝集鸡红细胞，判定为DHV单一TRIzol试~lJ(Invitrogen公司1说明，用SDS．蛋白酶K法提取感染。病毒RNA。反转录后，以反转录产物为模板进行PCR扩2．3分离病毒的血清学特性将DHV分离株与I型DHV标增。取10

6、．01．tl反应产物于10g／L琼脂糖中进行电泳分析。准阳性血清孵育，接种鸭胚。中和试验结果显示，分离1．5血清学特性观察取一定量的DHV分离株按1：2、株1：2稀释液被DHV阳性血清中和后，24～144h的鸭胚死1：20、1：200和1：2000倍稀释，加入等体积的I型DHV标准亡率为100％，1：2000稀释液被DHV阳性血清中和后，阳性血清，并加入终浓度均为100U／ml的青霉素和链霉24～l44h的鸭胚死亡率分别为80％，这株病毒与I型DHV阳素。于37"C温箱作用60min后，接种11～12日龄鸭胚各1O性血清的交叉保护率为

7、20％。枚(0．2ml／只)。另取5枚鸭胚经尿囊腔接种0．1mlDHV病毒表2I型DHv阳性血清对DHV分离株的交叉保护率液作为阳性对照，另取5枚不接种作为空白对照。相同条件下培养，连续观察7d。1．6毒力测定将DHV分离株进行1：1×10、1：1×10、1：l×10、1：1×10、1：1×10稀释，接种11～12日龄鸭胚各2．4分离株对雏鸭的致病性将分离株按照0．2ml／只接1O枚(0．2ml／只)。同时设空白对照组。接种后，弃去24h内种雏鸭，其对雏鸭的致死率为30％～60％。雏鸭在接种后死亡的鸭胚，每天观察鸭胚的死亡情况，连续观

8、察6d。2-3d达到死亡高峰，表现为突然发病、不食，死亡快，542014年第6期(总第209疾病防治浅谈试验中豚鼠的饲养及肺炎的防治李成功金凡茂陈壮志赵海蓉巫秀美术(大理学院云南省昆虫生物医药研发重点实验室云南大理671