鸭坦布苏病毒的分离、鉴定.docx

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1、鸭坦布苏病毒的分离、鉴定本研究从西南地区的某鸭养殖场无菌采集有疑似坦布苏病毒（Tembusuvirus,TMUV）症状的病鸭肝脏组织,开展了以下研究：疑似病毒的分离、鉴定；TMUV对鸭胚成纤维细胞及雏鸭的致病性试验；TMUV的全基因组序列的扩增、遗传进化分析。主要研究内容及结果如下：1.疑似病毒的分离、鉴定：采集的病料组织经剪碎、研磨、离心、过滤除菌后,接种于9日龄健康鸭胚并收集尿囊液按照常规病毒分离方法进行盲传。该病毒在鸭胚传代过程中,自盲传至3代以后,病毒液可导致鸭胚于3-4d内死亡,并致使鸭胚胚体水肿、出血,胚肝水肿、坏死。经鉴定,病毒的核酸类型为RNA,病毒为

2、有囊膜病毒,不耐酸,对氯仿、乙醚等有机溶剂敏感,符合黄病毒成员的基本生物学特征。对收集的尿囊液经PCR或RT-PCR检测,其他几种常见鸭源病原如鸭瘟病毒（Duckplaguevirus,DPV）、鸭圆环病毒（Duckcircovirus,DuCV）、鸭乙型肝炎病毒（DuckHepatitisBVirus,DHBV）、鸭源禽流感病毒（AvianInfluenzaVirus,AIV）检测为阴性。根据TMUV-WR株NS3-NS4片段保守序列设计的特异性引物通过RT-PCR方法扩增出疑似目的条带（1250bp）,经测序、比对后发现,与已公布的黄病毒科黄病毒属恩他耶病毒IPD

3、IA分离株核苷酸（GenBankNO:NC₀18705）相似性为72.3%,与国内己公布的TMUV分离株相比,同GX2013H株（GenBankNO:KJ700462）相似性最高,为99.4%,同1q-1株（GenBankNO:KF557893）相似性最低,为96.8%。综上所述,我们初步分离得到一株源于西南地区的鸭源坦布苏病毒,将其命名为CQW1。2.TMUV-CQW1株对鸭胚成纤维细胞及雏鸭的致病性试验：以鸭胚传代至第五代病毒液为母液,接种于单层致密的鸭胚成纤维细胞孵育,培养,观察。结果发现,攻毒后24h细胞开始出现圆缩,48h圆缩的细胞增多

4、,72h细胞内空泡串联形成较大空泡,细胞脱落死亡。表明CQW1可在鸭胚成纤维细胞上进行培养增殖,并可以引起明显的细胞病变。经测定,获取的病毒液滴度为105.5TCID50/0.05mL。选取20只7日龄樱桃谷雏鸭进行了动物回归试验,其中10只通过颈静脉注射0.2mL（含102.75ELD50）病毒液作为攻毒组,10只通过注射等量PBS溶液分笼饲养作为阴性对照组。结果发现,雏鸭攻毒后出现明显的食欲下降、不愿走动,精神萎靡、共济失调,死亡时呈角弓反张等神经症状。攻毒组共10只发病,发病率为100%,6只于攻毒后自然死亡,死亡率为60%；对照组无明显临床症状。动物回归试验结

5、果表明,CQW1株能够引起雏鸭死亡,死亡率可达60%。RT-PCR结果发现,能够从病鸭的血液、肝脏、大脑组织中检测到TMUV。病理学观察结果表明,CQW1株可导致脑膜血管充血、脱落,同时引起大脑组织神经胶质细胞增生,大量神经胶质细胞趋向坏死的神经元细胞,形成明显的“噬神经元现象”。另外可导致病鸭肝脏出血、淤血,大量肝细胞变性、坏死,肝小叶结构紊乱,同时存在有较多新生肝细胞。3.TMUV-CQW1株的全基因组序列的扩增及遗传进化分析：通过设计相互覆盖TMUVcDNA全长的引物,分段扩增、测序、拼接获得了CQW1株全长基因组序列（GenBankNO.KM233707）。全

6、基因组序列分析结果表明,CQW1株全长10992nt,含有一个开放阅读框（ORF）,编码一个长为2625aa的多聚蛋白,预测的多聚蛋白切割位点与其他TMUV成员一致,共编码10个功能蛋白。黄病毒代表成员以及坦布苏病毒分离株的进化树分析表明,CQW1株属于黄病毒属恩他耶家族成员,CQW1与其他TMUV成员在全基因组核苷酸和氨基酸相似性分别为96.8%-99.1%,98.4%-99.6%,与广西株GX2013H亲缘关系最近,两者够成了一个独立的进化分枝。与国内其他分离株相比,CQW1同其他分离株的平均进化距离（0.0299）高于其他毒株之间的平均进化距离（0.0163）,

7、表明CQW1株同其他分离株相比,有一定的地域差异。选取34条TMUVE基因按照不同年份分组进行分子变异分析,结果表明,TMUV的E基因遗传多样性随时间变化明显,且在2010-2013年之间以平均3.8×10-3/年的速率多样化,多样化速率相对其他黄病毒成员较快。另外,各年份之间以2010年遗传分化率最低,2011-2012相对平稳,而2013年的遗传分化率最高,显示出了该病毒在2010-2013年的遗传分化特征。