DB34∕T 2791-2016 鸭坦布苏病毒分离鉴定技术规程.pdf

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1、ICS11.220B41DB34安徽省地方标准DB34/T2791—2016鸭坦布苏病毒分离鉴定技术规程TechnicalRegulationforIsolationandIdentificationofduckTembusuVirus文稿版次选择2016-12-30发布2017-01-30实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T2791—2016前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽农业大学提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽农业大学、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽东方帝维生物制品股份有限公司、安庆永强农业科技股份有

2、限公司、太湖县徐桥镇综合农业服务中心、太湖县天华镇综合农业服务中心。本标准起草人：王桂军、占松鹤、肖华春、朱良强、祁克宗、耿照玉、刘雪兰、张星、陈静、刘红梅、周迎春、黄永强、胡凤华、李王平、王军。IDB34/T2791—2016鸭坦布苏病毒分离鉴定技术规程1范围本标准规定了鸭坦布苏病毒病料采集与处理、病毒接种及鉴定技术。本标准适用于鸭坦布苏病毒的分离与鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。DB34/T1938鸭黄病毒感染诊断技术规程3试验材

3、料、试剂3.19～11日龄SPF鸡胚3.211日龄鸭胚3.3乳仓鼠肾细胞(BHK-21)3.4DMEM培养基3.5胎牛血清3.60.01mol/LpH7.0～7.4磷酸盐缓冲液（PBS）3.7TAE缓冲液（50×）3.8青霉素、链霉素3.9琼脂糖3.10鸭坦布苏病毒琼脂扩散抗原（由鸭坦布苏病毒安徽分离株AH-F10株（CCTCCNo.V2012013）经甲醛灭活制备而成）3.11鸭坦布苏病毒琼脂扩散抗体（由鸭坦布苏病毒安徽分离株AH-F10株（CCTCCNo.V2012013）制备油乳佐剂灭活制剂免疫健康兔，分离血清制备而成）4病料采集与处理4.1病料的采集无菌采集疑似鸭坦布苏病

4、毒感染的病鸭卵巢、输卵管、胰腺和脑组织。样品应置于-80℃冻结保存。4.2病料的初步处理先将病料组织剪碎、研磨，用灭菌PBS与样品按体积质量比5：1匀浆，将样品匀浆放置于-20℃中冷冻，再室温融解，反复三次。经5000r/min离心10min，取上清，并加入青霉素和链霉素，终浓度为2000IU/mL，0.22μm过滤除菌，置于-80℃待用。1DB34/T2791—20165病料接种5.1鸡胚接种将上述病毒分离材料，以0.2mL/胚的接种量通过尿囊腔接种5枚9～11日龄SPF鸡胚，置37℃孵化箱内孵育，每天照胚2～4次，弃去24h内死亡的鸡胚，孵化至120h，将鸡胚放置4℃冰箱内放

5、置过夜，冷却收缩血管。无菌操作收集24h以后死亡鸡胚及120h仍存活鸡胚的尿囊液，并观察病变。5.2鸭胚接种将上述病毒分离材料，以0.2mL/胚的接种量通过尿囊腔接种5枚11日龄鸭胚，其余方法同5.1。5.3细胞培养取密度80％左右的单层BHK-21细胞，弃去培养液，用灭菌PBS清洗三次，接种0.5mL处理好的病料，置于5％CO2培养箱，37℃下吸附1～2h，期间每隔15min轻轻摇晃一次。吸附完后，弃去病料液，用灭菌PBS清洗三次，加入适量细胞维持液继续培养，37℃CO2培养箱内继续培养4d。在培养过程中每日观察细胞病变(CPE)产生情况，如出现CPE（特征病变为：细胞间隙增大

6、、细胞核固缩、细胞圆化脱落），收集细胞培养上清及细胞裂解液。同时设立不接种样品的空白细胞对照瓶。6病毒鉴定本标准使用RT-PCR方法对收集的鸡胚、鸭胚尿囊液及细胞培养物进行检测，方法详见DB34/T1938鸭黄病毒感染诊断技术规程，或者使用琼脂扩散试验对鸭坦布苏病毒进行鉴定。7琼脂扩散试验7.1琼脂糖凝胶板的制备用1×TAE缓冲液配置1％琼脂糖，煮沸溶解，冷却至60℃左右，倒入平皿（直径9cm）中制作琼脂糖凝胶板，琼脂糖凝胶厚度约4mm，完全凝固后备用。7.2打孔用梅花打孔器在上述琼脂糖凝固板上打孔，孔径5mm、孔距3mm。打孔结束后，取适量1％琼脂糖封底，以避免样品渗漏。7.3

7、加样用移液器在中间孔加入坦布苏病毒阳性血清，1号孔加入坦布苏病毒琼扩标准抗原，2～6号孔加入待测样品。每孔样品加满，不可溢出（图1）。完成加样后，将琼脂板倒置放入湿盒内，置于37℃培养箱中24～36h。2DB34/T2791—20161坦布苏病毒琼扩抗原26阳性血清35待测样品4图18结果判定8.1由本病毒致死的鸡胚及鸭胚具有基本相同的肉眼病变。胚体小、绒毛尿囊膜增厚、胚体充血及胚肝出血。8.2BHK-21细胞接种病料48h后，开始出现细胞核固缩、细胞圆化脱落。8.3RT-PCR