鸭新城疫病毒的分离鉴定及单克隆抗体的制备与应用

《鸭新城疫病毒的分离鉴定及单克隆抗体的制备与应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、山东农业大学硕士学位论文鸭新城疫病毒的分离鉴定及单克隆抗体的制备与应用姓名：杨建朋申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：刁有祥20120615山尔农业人学硕十学何论文中文摘要鸭新城疫，也称为鸭副粘病毒病(Duckparamyxovirusdisease．DPMV)是由禽I型副粘病毒(APMV-I)引起的以腹泻、瘫痪、神经症状和消化道、呼吸道粘膜充血、出血或溃疡等为主要特征的一种急性、高度接触性传染病。不同F1龄的鸭均易感，且同龄越小，易感性越高，发病率和死亡率也越高。以往水禽对APMV-I具有较强的抵抗力，仪表现为带毒，即使强毒感染也不致病(殷震等，199

2、7；Losovaceta1．，1988)。但近年来，APMV-I对鹅、鸭等水禽也产生了较强的致病作用【}91。是危害我国水禽业的一大重要疫病建立和完善鸭群体内DPMV的检测手段，是对该病进行流行病学调查以及预防控制的关键。DPMV各毒株之间毒力差异较大，采用常规的血凝抑制试验不易检测出其抗原结构的差异。单克隆抗体能够识别刺激宿主产生免疫反应的抗原表位，具有针对单个抗原决定簇的特异性，可以检测不同DPMV毒株间抗原表位结构的差异。制备抗鸭副粘病毒(DPMV)的特异性单克隆抗体，可为禽副粘病毒抗原性分析、建立快速检测试剂盒和免疫层析胶体会试纸条的研制奠定基础。建立E

3、LlSA检测方法和研制胶体会免疫层析试纸条，便于DPMV临床大量样品的快速诊断与现场检测样品的快速筛查。一：鸭新城疫病毒的分离及其F基因的分子特征从江苏省某鸭群中分离到1株病毒，经血清学试验和中和试验鉴定为鸭新城疫病毒，命名为JS0920株。生物学特性测定：半数致死量(ELD50)为10巧一，最小致死量平均死亡时间(MDT)为47．7h，1同龄SPF鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1．875，6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)为2．7。动物回归试验：鸭的发病率为70％，死亡率为40％：鸡的发病率和死亡率均为100％。用RT-PCR方法扩增该分离毒株的F基因，序

4、列分析表明，JS0920株与标准强毒株F48E9的核苷酸序列和氨基酸序列同源性最高，分别为99．2％和99．5％，其多肽裂解位点为112R．R．Q．R．R．Fll7，具有高致病性鸭新城疫病毒毒株的分子特征：系统发行进化树分析，JS0920株与F48E9株的亲缘关系最近，为丛因lX型。二t鸭新城疫病毒单克隆抗体的制备采用蔗糖密度梯度离心法提纯DPMV，片】甲醛灭活，免疫BALB／c小鼠，制备免疫肿细胞与SP2／O骨髓瘤细胞融合，采川fHJ接ELISA和I’HJ接免疫荧光试验(IFA)方法筛鸭新城疫病毒的分离鉴定及单克隆抗体的制备与应用选到4株能稳定分泌抗DPMV抗

5、体的杂交瘤细胞株，分别命名为2D7、2F6、3E4和3G2。免疫球蛋白亚类测定结果显示：2D7的Ig亚类为IgGl，2F6为lgG2b，其余2株为IgM，轻链均为k型。其中2D7还具有中和活性。特异性测定结果显示四株单抗与NDV、IBV、EDSV．76、IBDV(B87)、AIV(H9N2)及SPF鸡胚空白尿囊液均无交叉反应。三：双抗体夹心ELISA方法的建立及免疫胶体金层析试纸条的研制采用改良过碘酸钠标记法，用HRP标记纯化的单克隆抗体2D7，制备2D7．HRP酶标抗体复合物作为检测抗体，纯化的单抗2F6作为捕获抗体，建立双抗体夹心ELISA检测方法，可检测到

6、HA价为24的DPMV液。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，用纯化的单克隆抗体2D7标记，制备金标抗体玻璃纤维素膜：将纯化的2F6固定于硝酸纤维素膜(NC)上作为捕获抗体；组装成双抗央心法DPMV胶体会免疫层析检测试纸条。用该试纸条可特异检测DPMV，最低可检测血凝滴度为25的病毒量，在l～5min内可得出检测结果，特异性强，便于DPMV的临床快速诊断与现场检测样品的快速筛查。关键词：鸭新城疫病毒；F基因；单克隆抗体；夹心ELISA：胶体金免疫层析试纸条山尔农业人学硕十。’j．*s：1-、It论文Isolationofparamyxovirusfromvaccin

7、atedduckswithnewcastlediseasevirusandDevelopmentofmonoclonalantibodyagainstDPMVAbstractDuckParamyxovirusDiseaseisanacutesepticinfectiousdiseasethatcausedbyAPMV-I．Thediseaseismainlycharacterizedbydiarrhea，neurologicalsymptoms，focalglandulargastricbleedingorulcers，intestinalmucosalblee

8、dingandnecro