鸭源新城疫病毒分离鉴定、遗传进化分析及检测方法的研究

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1、广西大学硕士学位论文鸭源新城疫病毒分离鉴定、遗传进化分析及检测方法的研究姓名：陈安莉申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：谢芝勋20120525鸭源新城疫病毒分离鉴定、遗传进化分析及检测方法的研究摘要新城疫(Newcastledisease，ND)是由副粘病毒科腮腺炎病毒属的新城疫病毒引起的高度接触性传染病。水禽曾被认为是新城疫病毒的天然储存库，尤其是鸭，对ND有很强的抵抗力，一般鸭群中都潜伏有病毒，但不表现明显的临床症状。但自从1999年来不断有发生鸭源新城疫疾病的报道。2008．2010年从广西不同活禽市场鸭群中分离纯化了7株有

2、血凝性的病毒，这7株病毒的血凝性均能被新城疫标准阳性血清抑制，而不能被禽流感多种H亚型阳性血清抑制，经过HA、HI试验和R1PCR检测结果，确定为新城疫病毒。7株病毒的鸡胚平均致死时间(MDT)93．6h．162h，鸡胚半数致死量(ELD50)为10击一86／0．1mL一10-8．438／0．1mL，3株代表株的ICPI为O．15．0．30，推测该7株病毒为弱毒型NDV。为进一步探讨7株NDV鸭源NDV毒株GXl6／2008、GXl7／2009、GXl8／2009、GXl9／2009、GX20／2010、GX21／2010和GX22／20

3、10的分子病原学特征，运用RT-PCR方法获取了它们的全基因组序列，并对其进行了比较分析。此7株病毒的全基因组序列均由15186个碱基组成，与GenBank公布的LaSota、B1、Clone30、IrelandUlster67毒株的全基因组序列长度相同。F蛋白裂解位点的氨基酸序列表明所有的分离株都是无致病性的序列。7分离株中5株氨基酸顺序为112G．K．Q．G．R-Lm，2株为¨2G．R．Q．G．R-L117，绘制的进化树分析表明其中5株属于NDVs基因I型，2株属于基因II致它们在全基因组核苷酸和氨基酸水平上，发现与HMl25899W

4、DK／JX秫相似性较接近，而与F48E8、Mukteswar等毒株的同源性较低。根据NDVF基因的8个区域设计能区分强、弱毒株的3套特异性引物，并对反应温度、甜菜碱浓度)及M92十浓度分别进行优化，建立了新城疫病毒强弱毒株LAMP鉴别检测方法。结果表明该方法可成功地区别不同基因型的NDV强弱毒株，而对常见鸡源病毒均无扩增反应，该方法且对NDVRNA的最小检测限为0．01pg，灵敏度是RT-PCR方法的100倍，具有简便、快速和特异性高的优点，可用于临床上区分NDV强弱毒的快速检测。根据GenBank公布的NDV和DPV的基因序列，设计了针

5、对NDV和DPV的保守基因序列的2对特异性引物，运用二重PCR方法对加入同一反应管中的NDV和DPV模板进行检测，结果得到了2条大小与实验设计相符的419bp(r,rDv)并n602bp(DPV)ff勺特异性扩增条带，而其它禽病病原未见任何扩增条带，敏感性试验结果表明，该二重PCR技术最低能同时检出0．4pg的NDV模板和126pg的DPV模板。关键词：新城疫病毒；分离鉴定；全基因；遗传进化分析；LAMP；鸭瘟病毒；二重PCRIIISOLATION，IDENTIFICATION，PHYLOGENETICANALYSISANDDIFFERE

6、NTIALoFNEWCASTLEDISEASEⅥRUSFROMDUCKFLOCKSABSTRACTNewcastlediseasefN-D)，whichiscausedbyNewcastlediseasevirus，isamemberofRubulavirus，Paramyxoviridaeandisthehi#aycontagiousviraldisease．鼢f

7、erfowlswereconsideredtobethenaturalreservoirof加VDuckwereusuallyconsideredtoberesistantt

8、ovirulentNDVstrainsandmostlyharborlentogenicstrains．However,NDfromtheduel(constantlyoccuredsince1999．SevenisolatesofviruswereisolatedfromlivepoultrymarketofGuangxiintheyear2008and2010，whichwereabletoagglutinatechickenredbloodcells．TheseisolateswereneutralizedbyNewcastledi

9、seasevirusstandardantiseraandwerenotneutralizedbyavianinfluenzavirus(AIr)varioussutypesstandarda