鸭源黄病毒的分离鉴定及生物学特性初步研究

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1、安徽农业大学硕士学位论文鸭源黄病毒的分离鉴定及生物学特性初步研究姓名：赵圆圆申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：王桂军201206摘要2010年6月以来，我国部分地区蛋鸭养殖场暴发了一种传染病，以产蛋率突然急剧下降为特点，剖检发病鸭以出血性卵巢炎为共症，并迅速在我国大部分地区蔓延，给我国养鸭业造成了巨大的经济损失。为了解引发该病的病原及其生物学特性，对安徽地区2010年流行的发病鸭进行了病原分离及PCR检测，并对分离毒株进行了基因序列测定及分析，鉴定为鸭源黄病毒并命名为鸭源黄病毒AH．F10株。利用安徽分离株鸭源黄病毒AH-

2、F10制备油乳剂灭活疫苗，并进行免疫攻毒保护试验，为预防和控制鸭源黄病毒病提供技术支持和保障。首先，从发病鸭病变组织进行致病原的分离鉴定。无菌条件下采集产蛋下降病鸭卵巢、输卵管等组织制成研磨液，过滤除菌。通过尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚进行病毒分离。96h内收集尿囊液，利用ImPcR对其进行鉴定。结果表明：在pH值为7．2的条件下，鸡胚分离物对1％的鸡、鸭红细胞无凝集性。RT-PCR鉴定结果表明，鸡胚分离物鸭瘟病毒、鸭圆环病毒、新城疫病毒PCR呈阴性，但扩增出黄病毒NSl基因部分序列，其大小为260bp。测序结果分析表明其与黄病

3、毒科黄病毒属恩塔亚病毒群的巴格扎病毒(Bagazavims)病毒具有相近的遗传进化关系，与国内鸭源黄病毒核苷酸同源性达99％。由此可见，本次试验初步分离获得了一株鸭源黄病毒，命名为鸭源黄病毒AH．FlO株。证明安徽省已经存在鸭源黄病毒的感染。其次，对分离株进行鸡胚、鸭胚的致病性试验。将分离得到的鸭源黄病毒AH-F10株通过尿囊腔分别接种10日龄SPF鸡胚(0．2ml／枚)和11日龄鸭胚(0．2ml／枚)进行传代培养。鸡胚传代培养结果发现，96h内第一代鸡胚无死亡，第二代30％(3／1O)鸡胚死亡，第三代60％(6／10)鸡胚死亡。剖

4、检发现：鸡胚尿囊膜增厚，肝脏点状出血，斑驳状坏死，有的肝脏边缘有白色坏死灶；鸭胚肝脏土黄色，肿大出血。结果表明：鸭源黄病毒AH．F10株可通过SPF鸡胚和鸭胚进行传代培养，且随着鸡胚传代次数的增加，其毒力不断增强。第三，分离株对鸡胚成纤维细胞的致病性试验。取lO日龄SPF鸡胚，常规制作鸡胚原代成纤维细胞，将分离得到的鸭源黄病毒AH．F10株接种于鸡胚成纤细胞。24h时发现细胞开始出现圆缩，48h圆缩细胞增多，72h细胞开始脱落死亡，并且细胞折光性增强。结果表明鸭源黄病毒AH．F10株可以在CEF上传代培养，并可以引起细胞病变。最后，

5、鸭源黄病毒AH．F10株油乳剂灭活疫苗的制各及其免疫攻毒保护试验。利用安徽分离株鸭源黄病毒AH．F10，经一定浓度的的甲醛灭活后，与白油、司盘-80、吐温．80，按一定的比例混合，制备成鸭源黄病毒AH．F10油乳剂灭活疫苗，并对其进行物理性状、无菌检验、安全性检验、稳定性检验，检验结果合格。免疫攻毒保护试验：28周龄产蛋麻鸭随机分为四组，每组5只，分别为A免疫攻毒组、B攻毒组、c免疫组、D对照组；第ld时，A、C两组试验鸭均采用颈部皮下和肌肉注射方法免疫接种鸭源黄病毒AH．F10油乳剂灭活疫苗，剂量1ml／只；B、D组以同样的方法与

6、剂量注射无菌生理盐水。第14d时，A、B两组仍按上述方法接种鸭源黄病毒AH．F10病毒液，剂量为1ml／只。结果：B组在攻毒后第3d产蛋开始下降，第6d攻毒组鸭停止产蛋，持续到第20d后又产蛋1枚。剖检可见攻毒组鸭卵泡出现变性、萎缩、出血现象。提取卵巢、卵泡病变组织病毒RNA后，经ImPCR检测鸭源黄病毒结果阳性。而A免疫攻毒组、C免疫组以及D对照组接种鸭产蛋及剖检结果均正常，RT-PCR检测结果鸭源黄病毒阴性。试验证明，鸭源黄病毒AH．F10株油乳剂灭活疫苗对该病起到很好的保护效果。关键词：鸭源黄病毒，分离与鉴定，RT．PcR，油

7、乳剂灭活疫苗VAbstractSinceJune20lO，aninfectiousdiseaSeoutbreaksatpansofthelayingduckf．annsinourcountry，andwaLsquicklyspreadinmostareaofChina，whichischaracterizedbysuddena11dsha叩declineinlayingrate．Thecommonsymptomsishemorrhagicovarianinn锄mationwhen觚atomisingtheinfeCtedducks．

8、ThisepidemichascausedtremendouseconomiclossesforChinaduckindustry．InordertounderstandthebiologicalcharacteriSticsofth