新肝癌相关基因hta功能的初步研究

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1、中图分类号——UDC610博士学位论文学校代码!Q至三三密级公珏新肝癌相关基因HTA功能的初步研究Th,preliminyfunctionstudyof’hepatomaIIerellmlnaryunCtionstuanovelheatomaassociatedgeneHTA0ciateue1作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：论文答辩日期丝!≥!!．鲨刘艳红病理学与病理生理学基因工程抗体与肿瘤免疫治疗肿瘤研究所李官成教授答辩委员会主席选中南大学二0一三年五月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别

2、加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：鱼l圭边日期：趁!；年—L月二墨_日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。博

3、士学位论文中文摘要新肝癌相关基因HTA功能的初步研究摘要研究背景与目的肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是发病率高、恶性程度高、预后差的恶性肿瘤，其发病机制涉及多基因调控、多信号通路参与，是一个复杂的网络体系，其根源是基因表达异常。肝癌的传统治疗效果不理想，免疫治疗和基因治疗现已成为研究热点，在肝癌中异常表达的基因是其理论基础的核心。发现和研究新的具有应用前景的肿瘤相关基因仍是肿瘤研究的重要领域和难题。聚焦于肝癌相关基因的研究有望为肝癌的早期诊断、分子免疫治疗及预后分析提供有力的工具。对肝癌相关基因功能机制的深入研究不仅能丰富肝癌发生发展的分子机制和理论体系，

4、更重要的是为肝癌的临床诊断和治疗提供有力的标志物和靶点。HTA基因是本实验室通过生物信息学方法筛选得到的新肝癌相关基因，前期实验结果表明HTA基因不仅是一种特异性较强的肿瘤标志物，而且在肝癌的发生发展中起促进作用，故有望将其应用于肝癌的诊断和免疫治疗。同时，正因为HTA基因是从EST文库中新筛选发现的肝癌相关基因，前期研究只对其表达的特异性和促癌作用有了初步认识，但是关于该基因结构和功能机制方面的研究尚未开展，因此，本课题拟通过RACE和Northernblot等方法克隆HTA本课题受如下基金资助：1．国家自然科学基金，肝癌相关基因HTA的功能研究批准号：812019032．湖南省研究生

5、科研创新项目肝癌新标志物HTA的功能初步研究批准号：CX20118050TT博士学位论文中文摘要基因的全长并对其进行结构分析，对HTA基因编码的蛋白进行表达、纯化并制备单抗，用过表达手段研究HTA基因在肝癌细胞系的中的功能，并结合基因芯片、酵母双杂交、westernblot等多种细胞生物学、分子生物学、生物信息学、实验动物学等研究手段和策略深入探讨HTA基因在肝癌中的作用机制。方法(1)RACEPCR扩增HTA基因的全长并对其基因结构、可变剪接进行分析，对其编码蛋白的特点进行预测。Northernblot检测HTA不同转录本在肝癌细胞系及正常细胞系中的表达。(2)构建原核表达载体，在大肠

6、杆菌Rosetta中表达GST-HTA融合蛋白，用GST琼脂糖凝胶对融合蛋白进行纯化并用凝血酶切除GST标签，获得具有生物活性的HTA蛋白。以HTA蛋白为抗原，用杂交瘤技术制各单克隆抗体并鉴定。以该抗体用于westernblot、免疫细胞化学检测HTA在肝癌细胞中的表达，并初步研究HTA抗体抑制肝癌细胞系增殖的生物学功能。(3)构建HTA真核表达载体，在肝癌细胞系HepG2及HTA表达量较弱的肝癌宿主肝细胞系QSG．7701中稳定过表达HTA基因，通过细胞增殖实验、细胞周期检测、克隆形成实验、裸鼠成瘤实验等体内外实验检测HTA基因过表达对肝癌细胞系生物学表型的影响。(4)以干扰HTA基因

7、前后的HepG2细胞系总RNA为材料，全基因组表达谱芯片杂交筛选HTA相关差异基因。生物信息学GO分析和pathway分析HTA的相关差异基因及信号通路，实时荧光定量PCR和westernblot检测感兴趣的HTA相关差异基因，明胶酶谱实验、细胞粘附实验、侵袭转移实验等进一步验证HTA基因的生物III博士学位论文中文摘要学功能。(5)以HTA蛋白为诱饵，在标准化人cDNA文库中，用酵母双杂交方法筛选HTA的相互作用蛋白。结合生物信息