sle 相关基因 ifit1 免疫调节功能的初步研究

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1、SLE相关基因IFIT1免疫调节功能的初步研究【摘要】目的：研究系统性红斑狼疮（SLE）相关基因IFIT1的功能。方法：首先将IFIT1从穿梭表达克隆转入真核表达克隆，然后转导进入Jurkat细胞系，用有限稀释法筛选单克隆；再用CD3和CD28刺激单克隆，检测膜分子的表达、细胞凋亡、增生、细胞因子分泌等免疫生物学指标；最后应用RNAi技术，下调IFIT1的表达，检测细胞因子分泌，比较分析IFIT1的功能。结果：IFIT1的过度表达在T细胞中能诱导白细胞介素IL-4和IL-10的分泌增加，下调IFIT

2、1的转录水平后能部分下调IL-4和IL-10表达，而与细胞膜分子的表达、细胞的增生、凋亡无关。结论：SLE相关新基因IFIT1在细胞因子的产生中起了重要作用，可能与Thl/Th2的失衡有关。【关键词】系统性红斑狼疮；IFIT1；细胞因子；基因干预〔Abstract〕ObjectiveTostudythefunctionofIFIT1,anovelgeneassociatediclupuserythematosus(SLE).MethodsFirstanexpressioncloneofIFIT1in

3、ganLRrebinationreactionbetGenecopoieaandaGateitingdilutionmethod.ThestabletransfectantsofEGFPandIFIT1-EGFPulatedetry.Theapoptosisandexpansionofeachtransfectantanufacture'sinstruction.TheculturesupematantsoretransfectionofgenesilencevectorallRNAduplexes

4、partiallyblockedtheexpressionofoverexpressedIFIT1inJurkatTcel1.Thesameassaysulationolecules,apoptosisandexpansionamongJurkat,Jurkat/EGFP,andJurkat/IFIT1-EGFPtransfectants.ButitayplayanimportantroleintheproductionofcytokinesandmayinterfereintheTh1/Th2ba

5、lance.〔Key24594），按照网页上的要求设计靶序列特异的RNAi（选择IFIT1的mRNA起始编码下游4个位点195、653、1004及1241，每个位点长度为19个碱基，共8条序列），经Blasr验证后由深圳匹基公司合成。制备基因沉默的表达质粒按照产品操作说明书进行，经筛选扩增纯化。G418筛选多克隆，再将4种基因沉没质粒分别转染过表达细胞株，用荧光显微镜及定量PCR检测IFIT1-EGFP的表达，挑选出下调幅度最大的（>70%）沉默质粒进一步扩增。1.4.2下调IFIT1的mRN

6、A后观察细胞因子的分泌水平变化扩增培养Jurkat/1FIT1-EGFP细胞株，每2L沉默质粒转染2×l06个细胞，48h后，用CD3（1g/mL）和CD28（2g/mL）刺激细胞株，3d后检测细胞因子的分泌水平，同时以空白沉默质粒转染的Jurkat/IFIT1-EGFP细胞株为对照。1.5统计学处理所有资料均以均数±标准差（x±s）表示；差异的显著性检验采用t检验进行分析；P0.05作为显著性界限。2结果2.1IFIT1-EGFP稳定转染细胞系的建立电转导48h后，经荧光显微镜观察到约40%的细胞

7、表达荧光，经G418筛选4周后形成几个克隆细胞株，为验证其中IFIT1的表达水平，应用荧光定量PCR法检测细胞株中IFIT1的mRNA含量，结果显示Jurkat/IFIT1-EGFP细胞株比Jurkat/EGFP细胞株明显增高，差异有显著统计学意义（P0.05）（表1）。2.2细胞膜分子的表达使用平均荧光强度（MFI）来表示细胞膜分子的表达水平。经流式细胞仪检测，3个细胞株（Jurkat、Jurkat/EGFP和Jurkat/IFIT1-EGFP）之间，细胞膜分子的表达水平无显著性差异（表2）。2.

8、3CD3和CD28刺激后细胞因子水平3个细胞株用CD3（1mg/L）和CD28（2mg/L）刺激3d后，检测细胞因子的分泌水平，数据显示Jurkat/IFIT1-EGFP细胞株的细胞因子IL4及IL-10的产量明显高于其它2个细胞株，而IL-2和IFN-γ在3个细胞株间的变化并不明显（表3）。2.4地塞米松诱导的细胞凋亡3个细胞株（Jurkat、Jurkat/EGFP和Jurkat/IFITl-EGFP）流式细胞仪检测，凋亡细胞百分比分别为8.75%、5.02%、6.