MiR-182靶向p53调控急性心肌梗死中细胞凋亡的作用机制

《MiR-182靶向p53调控急性心肌梗死中细胞凋亡的作用机制》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、单位代码10475学号104753140933分类号R392硕士学位论文MiR-182靶向p53调控急性心肌梗死中细胞凋亡的作用机制学科、专业：基础医学、免疫学研究方向：肿瘤免疫申请学位类别：医学硕士申请人：李慧导师：马远方教授赵昆朋副教授二〇一七年六月THEMECHANISMOFMIR-182REGULATEAPOPTOSISBYTARGETINGP53INACUTEMYOCARDIALINFARCTIONThesisSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUniversityinPartialFulfillmentoftheRequi

2、rementsfortheDegreeofMasterofMedicineByHuiLiSupervisor:Prof.YuanfangMaAssociateProf.KunpengZhaoJune,2017摘要背景MicroRNA（简称miRNA）是一类含量丰富、进化上保守的非编码RNA分子，大约由19-25个核苷酸组成，它通过与靶mRNA的3′非编码区结合来抑制转录后翻译过程，或者促进其降解，从而负性调控靶基因的表达。MiRNA介入多种调节路径，包含发育、细胞增殖分化和凋亡、器官形成、组织代谢等，在生物体生长过程中发挥重要的基因表达调控作用。急性心肌梗死在我国发病

3、率高、死亡率高，且发病年龄有年轻化的趋势。多项研究表明miRNA对于调控AMI后心肌细胞凋亡、心脏血管再生、纤维化和心肌细胞肥大发挥重要作用。这些发现提示miRNA可能参与心脏缺血疾病的病理过程，从而使miRNA可能成为靶点来改善心梗的临床诊治。研究表明心梗后急性抑制或过表达部分miRNA可能会有助于减少组织损伤，改善新生血管的形成，并防止随后的负性心脏重塑导致的心衰。miRNA在心梗中的研究为解决AMI的临床治疗提供了新的思路。我们通过建立大鼠急性心肌梗死模型，检测miRNA在心肌组织中的表达差异情况，从而探索miRNA调控AMI中细胞凋亡的信号通路，为心梗疾病的治

4、疗提供新的策略。目的建立大鼠急性心肌梗死模型，并探讨miR-182在大鼠急性心肌梗死中细胞凋亡的分子机制。方法1.模型建立及验证：我们选择8周龄的wistar雄性大鼠，根据随机数字表将大鼠随机分成两组，实验组（即心梗组）和假手术组（即sham组），实验组大鼠开胸后结扎左冠状动脉前降支，使心肌分别缺血3小时和6小时，sham组只开胸不结扎。模型建立后，首先用TTC（即2,3,5-氯化三苯基四氮唑）进行心脏组织染色，观察有无缺血。其次于结扎前及结扎后6小时，分别采集大鼠的静脉血，检测血清中心梗标志物肌钙蛋I白及肌红蛋白的含量。再次进行HE染色（Hematoxylin-eo

5、sinstaining，苏木素-伊红染色），观察心脏组织变化情况。最后进行TUNEL染色，检测心梗模型中心肌组织凋亡情况。2.实时荧光定量PCR（qPCR）：Trizol法提取心梗3小时、6小时及sham组心脏组织总RNA，进行逆转录合成cDNA，然后进行qPCR检测miRNA的mRNA表达水平，反应结束后运用2-ΔΔCT对样品的Ct值进行基因表达分析。3.免疫印迹及免疫组化：通过免疫印迹法（WesternBlotting，WB）测定心肌组织中miRNA下游靶点蛋白的表达情况，再通过免疫组织化学法验证心肌中靶点蛋白Bax、caspase3的表达情况。4.细胞缺氧模型建

6、立及miR-182的表达情况检测：建立H9C2心肌细胞缺氧模型，通过MTS、LDH及caspase3/7活性进行验证，用qPCR检测miR-182在缺氧模型中的表达情况。5.核质分离：心肌组织及H9C2心肌细胞按照试剂盒说明书进行核质分离实验，提取细胞成分蛋白，进一步检测心梗中细胞凋亡过程的蛋白表达变化。结果1.建立大鼠急性心肌梗死模型后，TTC染色大鼠心肌组织，实验组梗死区呈白色，非梗死区呈红色，sham组全部呈现红色。2.与sham组对比，心梗6小时后，实验组心梗标志物肌钙蛋白、肌红蛋白含量明显升高。3.HE染色后观察到实验组梗死区心肌组织结构混乱，并有炎症细胞的

7、浸润。4.TUNEL法检测大鼠心梗6小时的心脏组织，实验组中梗死区出现明显的细胞凋亡，sham组仅有个别细胞凋亡现象。5.qPCR结果显示，同sham组相比，梗死6小时后miR-206的表达显著上调，miR-1b、miR-10b-5p、miR-122、miR-132、miR-133a-3p、miR-155、miR-182的表达明显下调。而且miR-182、miR-155在梗死3小时后即显著下降，而miR-10b-5p在梗死3小时后未II出现下降，在梗死6小时才表达下调。6.WB检测miR-182的候选靶点Hif-1α、FoxO3a、p53及凋亡相关蛋