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1、PBDE-47致SH-SY5Y细胞凋亡中p53作用及其活化机制探讨'研究生：匡刚导师：王爱国教授摘要多浪联苯醸(polybrominateddiphenylethers,PBDEs)是V臭代阻燃剂(brominatedflameretardants,BFRs)类化合物的一种，是一种新型的持久性有机污染物(PersistantOrganicPollutants,POPs),因其添加量少、热稳定性好、阻燃效率高、对材料性能影响小、价格低廉等众多优点而广泛被应用于社会生产及生活的多个领域。目前PBDEs广泛存在于多种环境介质和人体牛物材料中，且含量呈现逐
2、年增加的趋势。体内和体外实验均发现，PBDEs暴露可导致多种健康危害，包括肝脏毒性、生殖毒性、神经毒性及神经发育毒性、内分泌干扰作用及致癌作用等。肿瘤抑制因了p53(tumorsuppressionfactorp53)基因被称为人类基因组卫士，是细胞内重要的抑癌基因之一，其编码产物为53kD的P53蛋白。野生型P53蛋白是细胞内重要的细胞周期“监控器”，正常情况下对细胞分裂起着减慢或监视的作用，当细胞内发生DNA损伤，野生型P53蛋白可介导细胞周期的阻滞，同时进行细胞内DNA修复，若修复无效则通过启动凋亡机制诱导受损细胞发生凋亡。研究显示，多数肿瘤
3、中可发现p53基因的突变，发生突变的p53基因由抑癌基因转变为癌基因，编码产物为突变型P53蛋白，其细胞周期监测功能完全丧失，并且可以抑制野生型P53蛋白的正常功能，从而导致受损细胞异常增殖，并最终导致正常细胞转变为癌细胞。细胞凋亡(Apoptosis)又称程序性细胞死亡(ProgrammedCellDeath,PCD),是指细胞为了维护内环境稳定，由基因调控的细胞自主的有序死亡。有研究显示，一定剂量的2,2',4,4'・四漠联苯醍(2,24,49-tetrabromodiphenylether,PBDE-47)可诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y
4、细胞发牛凋亡。木实验室前期研究也显示，在PBDE-47诱导SH-SY5Y细胞凋亡过程中，Fas、细胞色素C(CytochromeC,CytC)表达水平增高，1国家口然基金面上项目(30872081)Pro-Caspase8及Pro-Caspase3细胞内水平下降。研究己证实，与PBDEs结构相近的多氯联苯(Polychorinatcdbiphenylsethers,PCBs)能够引起细胞内P53蛋口表达水平增高，并引发p53依赖性凋亡通路的激活。是否PBDE-47亦能同样引起SH-SY5Y细胞P53蛋白表达水平增高尚无定论，仍需进一步研究。DNA甲
5、基化修饰是表观遗传学(Epigenetics)中十分重要的一种修饰方式，是由DNA甲基转移酶(DNAmethytransferse,Dnmts)催化，将S■腺背甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)提供的甲基转移至DNA中CpG二核莒酸中的胞脚定上的第五位碳原子上，形成5■甲基胞噺定(5-methyleytosine,5mC)的过程。目前研究认为，DNA甲基化可使基因发牛沉默，降低其表达水平，而去甲基化改变则与之相反，可使已甲基化沉默的基因重新获得表达。鉴于PBDE-47是否引起神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞内p53mRNA和
6、蛋白表达水平增高及p53基因去甲基化改变的情况尚未见文献报道。因此，木研究拟通过体外培养SH-SY5Y细胞，并处以不同剂量的PBDE-47,观察p53基因及蛋白表达水平的变化及p53基因启动子区的去甲基化改变情况，从而探讨p53在PBDE-47所致的SH-SY5Y细胞凋亡中的作用。木研究包括以下二部分：第一部分PBDE-47对SHSY5Y细胞p53mRNA及蛋白表达水平的影响0的探讨PBDE-47对SH-SY5Y细胞p53mRNA及蛋白表达水平的影响。方法体外培养的SH-SY5Y细胞并暴霜于不同浓度的PBDE-47(1,5,10gmol/L),以二
7、甲基亚W(DMSO)作为溶剂对照，染毒24h后，使用实吋荧光定量PCR(Real-timePCR)技术检测p53mRNA表达水平变化，同时使用WesternBlot技术检测P53蛋口表达水平的改变。结果Real-timePCR结果显示1、5pmol/L染毒组p53mRNA表达水平显著高于对照组(p<0.05)；10
8、.imol/L染毒组p53mRNA表达水平显著高于对照组及1、5gmol/L染毒组(严0.05)。WesternBlot结果显示，5gmol/L染毒组P53蛋白表达水平显著高于对照组及1pmol/L染毒组(/?<0.05)；10pmol
9、/L染毒组P53蛋口表达水平显著高于对照组及1pmol/L、5pmol/L染毒组（严0.05）。结论一定剂量的PBDE-4
