miR-155通过Rheb_mTOR信号通路对缺血性脑卒中大鼠模型及细胞缺氧缺糖模型的影响.pdf

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1、分类号：R74密级：公开学校代码：11065学号：y0115130057专业博士学位论文miR-155通过Rheb/mTOR信号通路对缺血性脑卒中大鼠模型及细胞缺氧缺糖模型的影响作者姓名邢国平指导教师潘旭东教授专业领域神经病学培养单位医学部临床医学系答辩日期2018年5月18日miR-155通过Rheb/mTOR信号通路对缺血性脑卒中大鼠模型及细胞缺氧缺糖模型的影响摘要目的：采用大脑中动脉阻断大鼠模型和体外细胞缺氧缺糖模型。探讨miR-155和Rheb/mTOR通路在缺血性脑卒中发生中的作用；研究miR-155和Rheb/mTOR通路在缺血性脑

2、卒中发生中的交互作用。方法：研究采用大脑中动脉阻断大鼠模型和体外细胞缺氧缺糖模型模拟缺血性脑卒中发作。分别应用miR-155mimics、miR-155inhibitors和RhebsiRNA以改变miR-155和Rheb的表达水平。采用TTC染色测定脑梗塞范围；使用annexinV-FITC/PI标记和流式细胞仪测定细胞凋亡；采用RT-PCR、免疫荧光和免疫印迹杂交测定miR-155、Rheb、mTOR、S6K和p-S6K表达水平。利用荧光素酶活性测定评估miR-155和Rheb之间的关联。1.动物模型中慢病毒转染：建立SD大鼠大脑中动脉阻断

3、（MCAO）模型。两组片段分别包含miR-155mimics和miR-155inhibitors装载入pCDH载体。将相应pCDH载体等一起转染大鼠，转染后48小时收集。分别将慢病毒构建物（阴性对照、miR-155mimics和miR-155inhibitors）在MCAO手术前24小时注入大鼠侧脑室。48只大鼠随机分为4组：对照组（12只大鼠，进行假手术和阴性对照注射）；模型组（12只大鼠，进行MCAO手术和阴性对照注射）；miR-155模拟组（12只大鼠，进行MCAO手术和miR-155mimics注射）；miR-155抑制剂组（12只大鼠

4、，进行MCAO手术和miR-155inhibitors注射）。2.动物模型中用TTC染色评估脑梗塞情况：组织切片置于2％的TTC染液中，在37℃黑暗条件下染色20分钟，然后将切片固定于4％多聚甲醛磷酸缓冲液中1小时。脑梗塞比率计算方法：梗塞体积/总体积。3.动物模型的免疫荧光：将大鼠脑组织速冻、切片，先与初级抗体Rheb孵育，再与第二抗体辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG孵育。切片经水合、洗涤，用二氨基联苯胺染色，显微镜下进行结果观察。4.细胞培养：BV2细胞在用Dulbecco改良的Eagle培养基中培养，加入谷氨酰胺、青霉素、链霉素和10％小

5、牛血清。培养条件为37℃、5％CO2。5.BV2细胞缺氧缺糖（OGD）模型建立：对照组中，BV2细胞在DMEM中培养，常氧条件（21％O2和5％CO2）并加入4.5g/mL葡萄糖。OGD模型中，BV2细胞在DMEM培养基中培养，低氧条件（5％CO2和95％N2）且培养基中未加入葡萄I糖或血清。6.细胞转染：使用脂质体2000转染BV2细胞。转染后24小时，按照对照组和OGD模型组细胞的上述控制条件再培养4小时。然后，分别用不同载体转染细胞。并将细胞在对照组和OGD模型组特定条件下培养。将BV2细胞分为5组：对照组（对照组条件下和特定空质粒转染细

6、胞）；OGD组（OGD条件下和特定空质粒转染细胞）；miR-155模拟物组（OGD条件下和miR-155mimics转染细胞）；miR-155抑制剂组（OGD条件下和miR-155inhibitors转染细胞）；miR-155抑制剂+RhebsiRNA组（OGD条件下，miR-155inhibitors+Rheb-siRNA转染细胞）。7.细胞凋亡检测：采用凋亡检测试剂盒，AnnexinV-FITC/PI标记和流式细胞仪测定细胞凋亡。8.荧光素酶活性检测：PCR扩增Rheb的3'UTR。将该PCR产物克隆到psiCHECK-2荧光素酶载体。采用

7、GeneTailorSite-DirectedMutagenesisSystem突变相应结合位点。48孔板中培养BV2细胞，然后将不同载体转染入细胞：一组用200ngpGL3，10ngpRL-TK载体和miR-155载体；另一组为200ngpGL3，10ngpRL-TK载体和阴性对照载体。转染48小时后对转染细胞进行分析。9.RNA提取和RT-PCR：使用TRIzol试剂分别从脑组织和BV2细胞中分别提取总RNA。总RNA用ReverTraAceqPCRRTKit试剂盒转录成cDNA。然后，使用SYBR®qPCRMix和CFX96实时PCR检测

8、系统进行RT-PCR。用GAPDH对目标基因的表达水平进行标准化，使用2-ΔΔCT方法量化靶基因表达。10.免疫印迹杂交检测：采用RIPA缓冲液裂解组