波动性高糖对成年大鼠神经干细胞缺血缺氧损伤及mapk通路的影响

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文波动性高糖对成年大鼠神经干细胞缺血缺氧损伤及MAPK通路的影响Effectsofintermittenthighglucoseonadultratneuralstem：ellsinhylz""：hemiciniuryassellasthepressionofcellsllyDoxic-lSCllemuryaswellastIieexPresslonlmitogen··activatedproteinkinasesignalingpathway课题来源：国家自然科学基金(30801l84)广东省科技计划重点专项(2011A030400007)专业名称

2、学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员神经病学谢惠芳副教授杨卫红副教授刘振华教授刘亚杰副主任医师论文评阅人陶玉倩副教授杨卫红副教授2012年4月30日广州硕士学位论文波动性高糖对成年大鼠神经干细胞缺血缺氧损伤及MAPK通路的影响硕士研究生：陈健导师：谭盛摘要基础和流行病学研究证实，糖代谢异常【包括糖尿病、空腹血糖受损(impairedfastingglucose，IFG)和糖耐量减低(impairedglucosetolerance，IGT)】与缺血缺氧性脑损伤之间存在着密切的内在联系。葡萄糖作为脑组织最重要的能量来源，其水平过高或过低都会影响神经功能、造成不同程度的脑损伤

3、。低血糖与高血糖均是脑梗死的重要危险因素，两者在脑梗死防治中具有同等的重要性。控制血糖水平波动对减轻脑缺血再灌注引起的损伤具有一定的意义。急性脑缺血可诱导脑内神经干细胞增殖、分化现象，促进自我修复，但其增殖数量上的不足致使自我修复功能受限。已有研究表明，血糖水平是限制缺氧后神经干细胞存活和自我更新能力的关键因素。血糖水平波动是否影响缺血缺氧环境下神经干细胞的存活和增殖能力，进而限制了其对神经损伤的自我修复功能?目前，相关研究还不多见。既往研究大都集中在持续性高浓度葡萄糖对神经干细胞的存活、增殖及凋亡的影响研究，并认为一定浓度的高糖对神经干细胞缺血缺氧损伤具有保护作用。但是在实际临床

4、实践中，急性脑卒中患者病程的进展过程极不稳定，患者体内血糖容易出现频繁的波动改变，数值差距变化浮动大，所以以往的研究模式不能完拿客观真实地反映糖尿病患者体内由于血糖的不断变化而对神经干细胞产生的损伤效应。因此，本实验用成年大鼠神经干细胞在体外建立缺血缺氧损伤模型，并模拟脑梗死患者缺血后出现的血糖波动现象，采用免疫荧光细胞化学染色、流式细胞术和Westernblot等技术方法观察波动性与持续性高浓度葡萄糖对缺血缺氧条件下培养后的神经干细胞存摘要活、增殖能力和MAPK信号通路的的影响，从而从另外一个角度探索波动性高血糖加重缺血性脑损伤的病理机制，进而为临床上脑缺血患者急性期血糖控制提供

5、一定的参考。第一部分成年大鼠神经干细胞体外缺血缺氧损伤模型的建立目的：探讨一种简便、稳定、可重复的大鼠成年神经干细胞体外缺血缺氧损伤模型制备方法。方法：l、细胞来源：采用来自于成年Fisher344大鼠的海马神经干细胞系(ANSCs)为研究对象，无血清培养基培养并传代，用巢蛋白(Nestin)和DAPI免疫荧光双染技术检测其神经干细胞生物学特性。2、建立体外神经干细胞缺血缺氧损伤模型的方法：三气培养箱物理缺氧、无糖Earle’s平衡盐溶液缺糖相结合的方法，即将三气培养箱氧气浓度调至l％，制备缺氧环境，将培养基换为不含葡萄糖的Earle’s培养基，分别缺氧2h，4h，6h，8h，10

6、h后取出细胞，更换为正常神经干细胞基础培养基，恢复正常条件继续培养，同时设置常氧常糖正常对照。3、细胞形态学、活力及凋亡改变检测：缺氧缺糖2．10h不等时间后，恢复正常条件继续复氧培养24h，观察细胞形态学、细胞活力以及细胞凋亡率改变：倒置显微镜下观察各组细胞形态变化；CCK．8比色法测定细胞活力变化：AnnexinV-FITC／PI双染流式细胞术测定细胞凋亡率。比较不同缺氧时间对细胞的损伤程度，确定适合神经干细胞的合适缺氧缺糖时间。结果：l、培养体系中的细胞94％以上呈Nestin强阳着色，说明其94％以上细胞均处于原始未分化状态，并具有增殖能力，可用于后续实验。2、缺糖缺氧2h

7、时，神经干细胞活力未见下降反而存活率有一定的增加。但随着缺氧缺糖时间延长，细胞存活率逐渐下降，凋亡率逐渐增高，且缺氧缺H硕士学位论文糖6h起细胞结构完整性开始受到破坏，细胞存活率较正常对照组显著下降，比较差异有统计学意义(P