rhg-csf对新生缺氧缺血脑损伤大鼠脑组织ngr表达的影响

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1、贵阳医学院2013届硕士研究生论文实验一免疫组化法检测rhG-CSF对新生缺氧缺血脑损伤大鼠脑组织NgR蛋白表达的影响材料与方法1.实验材料1.1主要试剂乙醚国药集团化学试剂有限公司，20110517水合氯醛成都市科龙化工试剂厂，20071226重组人粒细胞集落刺激因子深圳新鹏生物工程有限公司山羊抗大鼠Nogo-R(N-20)美国santacruz，sc-16707山羊超敏二步法免疫组化Kit北京中杉金桥，PV-9003DAB显色试剂盒北京中杉金桥，ZLI-90174%多聚甲醛贵州省人民医院病理科免疫组化室提供柠檬酸修复液贵州省人民医院病理科免疫组化室提供1.2主要实验仪器60

2、0数显三用恒温水浴箱金坛市友联仪器研究所密闭缺氧舱上海新华医院研究所8%O2+92%N2混合气贵阳申建气体公司倒置显微镜日本Nikon，TE-2000电子天平美国HuaZhi，HZT-B1000光学显微镜重庆光学仪器厂，XSZ-H图像分析软件Imageproplus6.01.3制作模型的主要器械及材料手术台、眼科剪、弯眼科镊、直眼科镊、持针钳、缝合针、3-0无菌缝合丝线等2.实验方法2.1实验动物分组由贵阳医学院实验动物中心提供新生7日龄SpragueDawley（SD）大鼠（清洁级，母鼠带养）96只，雌雄不限，体重10-15g，动物随机成四组：Ⅰ组：假5贵阳医学院2013届硕

3、士研究生论文手术组；Ⅱ组：HIBD模型组；Ⅲ组：小剂量组；Ⅳ组：大剂量组，每组各24只。每组根据处死时间点又分四个亚组：24h、72h、7d、14d，每个亚组6只。1.HIBD模型建立Ⅰ组仅分离左侧颈总动脉，不行结扎及缺氧操作，缝合皮肤后，送回母鼠身边喂养。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组新生7日龄SD大鼠，术前称重、标记编号，乙醚吸入麻醉后，仰卧位固定于手术台上，酒精、碘伏依次消毒皮肤，切开颈部皮肤，暴露颈前肌肉群，分离肌肉至气管，在左侧颈动脉三角可见到搏动的颈总动脉，小心分离左侧颈总动脉，用3-0无菌丝线结扎颈总动脉近心及远心端，并从中间剪断血管，缝合皮下组织及皮肤，并依次消毒皮肤。整个手术过

4、程保证在10min内完成。术后待大鼠清醒后放入置于37℃恒温水浴箱内的缺氧舱中，向缺氧舱内通入8%O2+92%N2混合气，流量1L/min，持续2h，缺氧过程中死亡率控制为20%。缺氧结束后待大鼠生命体征平稳，如皮肤红润、自主呼吸均匀、自由爬行等，送回母鼠身边喂养。2.给药方法将rhG-CSF用0.9%生理盐水稀释成16μg/ml，Ⅲ、Ⅳ组分别于造模后即刻颈部皮下注射rhG-CSF50μg/kg、100μg/kg，Ⅱ组造模后即刻给予颈部皮下注射与Ⅳ组等量的生理盐水，每24h给药一次，连续7天；Ⅰ组不作处理。3.取材及标本处理1.1脑组织标本的取材大鼠按分组情况分别于造模后24h

5、、72h、7d、14d取材，将大鼠用10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔麻醉后，开胸暴露心脏，打开心包，用60ml注射器接头皮针向左心室内灌注无菌生理盐水，同时剪开右心耳，至流出液体变清，肝脏及肺脏变白后，继续灌注4%多聚甲醛，至大鼠僵硬后，断头取全脑组织，于4%多聚甲醛中常温固定72h以上。1.2标本处理取固定好的脑组织，从视交叉及其后5mm处行冠状切面（包括海马区），经过脱水、石蜡包埋后，切片，贴片于防脱载玻片上，60℃烤片2h备用。4.HE染色1）脱蜡：二甲苯浸泡15min6贵阳医学院2013届硕士研究生论文2）脱蜡后的切片经95%酒精1min×2次3）苏木素染色5-1

6、0min4）流水冲洗1min5）1%盐酸酒精分色1-3sec6）流水冲洗5-10sec7）饱和碳酸锂水溶液复蓝15-20sec8）流水冲洗1min9）1%伊红液染色1-3min10）流水冲洗1min后，经80%、90%、95%、无水乙醇梯度脱水各2-3sec11）水杨酸甲酯1-2min12）二甲苯1-2min×2次13）中性树胶封片，光学显微镜下观察脑组织病理学形态改变1.NgR免疫组化染色1）脱蜡：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各浸泡5min2）脱蜡后的切片经95%酒精脱水1min×2次3）蒸馏水脱酒精数秒4）PH6.0柠檬酸修复液预热，放入切片修复120℃1分30秒，自然冷却5）蒸馏水洗1m

7、in6）3%H2O2孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶7）PBS冲洗2min×3次8）滴加一抗（NgR，1:100），湿盒中4℃过夜，PBS冲洗2min×3次9）滴加聚合物辅助剂（PolymerHelper），37℃孵育15min10）滴加poly-HRPanti-GoatIgG，37℃孵育15min11）自来水冲洗，苏木素复染1min，0.1%盐酸酒精分化，自来水返蓝12）滴加DAB显色试剂显色，显微镜下观察显色，自来水适时终止13）自来水冲洗切片5min14）经95%酒精、无水乙醇梯