缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织水通道蛋白9实验研

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1、缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织水通道蛋白9实验研【摘要】目的研究缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后水通道蛋白9(AQP9)在脑组织中的表达变化规律,初步探讨AQP9与脑水肿的关系。方法采用HIBD动物模型,实施定量PCR(基因水平)和ethodsHIBDanimalmodelinethechangesofAQP9expressionandAQP9mRNA.ResultsAQP9expressionhadnoobviouschangeinthecontrolgroup，butintheHIBDgroup,AQP9expressionincreasedeofi

2、schemia,anditreacheditshighestlevelonthesecondandthirddayofischemia.ConclusionsInhypoxicischemicbraindamage,AQP9expressionincreaseseofhypoxiaandischemia,anditreachesitshighestlevelat72hours.　　【Keyage/pathology;Cerebralischemia;Cerebralhypoxia;Cerebraledema;AQP9;Rats;Animal，expe

3、riment　　缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后,大脑组织将发生一系列的病理生理变化。其中能量代谢变化和水电解质平衡的紊乱始终贯穿于HIBD。研究表明,水通道蛋白9(aquaporin9,AQP9)与大脑的能量代谢和水电解质平衡密切相关[1]。因此研究HIBD后AQP9的表达,探索其在HIBD不同时间段的变化规律,有望能为进一步阐明HIBD后脑水肿的病理生理机制提供实验依据,并为临床治疗提供新思路。本文通过对新生鼠HIBD模型AQP9与脑水肿关系的研究旨在为今后治疗脑水肿开辟新的途径。　　1材料和方法　　1.1实验动物200906/08取健康7日龄SD

4、新生大鼠共40只，体质量在12～18g,雌雄不限,由哈尔滨医科大学附属二院动物中心提供(动物合格证号：黑动字DT00102008)。采用随机数字表法分为对照组和HIBD模型组各20只。所有动物均按照国家实验动物饲养和使用指南,动物饲养在实验室,室温稳定在20℃,12h明暗交替。　　1.2标本取材实验材料及设备外科手术器械一套，操作台，绑鼠板，无影灯，台灯(60emPER(89826)。MMLV逆转录试剂盒:PromegaCat#A3500(100个反应)。　　AQP9引物上游序列:5′TTGGACCATCATAGGCGC3′,下游序列:5′GCA

5、TGTGATCGACATTGACC3′,扩增片段长698bp,TRIZOLReagent(美国Invitrogen公司)，0.2mLPCR管,0.5、1.5mL离心管,10、200、1000μL吸头(美国Axygen公司)3mL匀浆器，氯仿(三氯甲烷)，异丙醇,75%无水乙醇(DEPC水配制)。　　核酸蛋白检测仪(德国Eppendorf公司)，HimacCF16RX低温冷冻高速离心机(日本HITACHI公司)，Gilson和Dragon微量加样枪0.2～1000μL,荧光定量PCR仪LightCycler2.0(德国Roche公司)，超纯水系统(Sa

6、rtofus公司,德国)，垂直电泳和转膜系统(BioRad公司,美国)，恒温循环水浴箱，电子天平(Sartorius公司,德国)，Forma-80℃低温冰箱(Forma公司,美国)，西门子-20℃冰箱(sietnens公司,德国),Eppendorf5415D微型离心机(Eppendorf公司,德国)，Vortex2振荡器(sI公司,美国)。　　1.4实验方法　　1.4.1HIBD动物模型的建立新生鼠乙醚吸入作为基础麻醉,消毒皮肤,2%盐酸普鲁卡因颈部局部麻醉;切开皮肤及皮下组织,分离左侧颈总动脉,并用70号灭菌丝线双线结扎;置鼠于常氧空气中30m

7、in后,放进含8%O2和92%N2混合气体的低氧舱,流量为2L/min,处理3h,环境温度为34℃,湿度为85%，低氧处理结束后的新生鼠放回含常氧的母鼠笼中饲养1h,模型建成;对照组仅行假手术,不予颈总动脉结扎和缺氧。两组均于HIBD模型制成后6、24、48、72h分别处死动物(各时间点动物5只),断头取新生鼠左脑，置于液氮中保存。　　1.4.2RTPCR分析(实时定量PCR)　　1.4.2.1总RNA的提取应用Invitrogen公司Trizol总RNA提取试剂,按说明书提供的方法分别提取细胞总RNA。　　1.4.2.2cDNA第一链的合成配置RT

8、Mix，取上述cDNA为模版进行RTPCR扩增。　　1.4.3WesternBlot　　1