小檗碱胆酸衍生物b4诱导smmc-7721肝癌细胞凋亡机制

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1、万方数据UniversityCode：10225RegisterCode：S13673DissertationfortheDegreeofMasterTheapoptosismechanismofanovelberberinebileacidanalog(B4)towardshepatocellularcarcinomaSMMC．7721cellsCandidate：Supervisor：AssociateSupervisor：AcademicDegreeAppliedfor：Speciality：DateofOralExaminatio

2、n：University：ZhangLiProfessorLiQing-yongMasterDegreePharmacochemistryJune，2013NortheastForestry万方数据摘要lllllllIIWIIIIll011Y2721473小檗碱对许多肿瘤的生长都有一定的抑制效果，包括肝细胞癌、结肠癌、肺癌、口腔癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌等。尽管小檗碱在胃肠道中状态稳定，但是体内吸收不好，导致血药浓度低，生物利用度也不好，影响了对其的有效利用。为了进一步降低小檗碱的毒性，增强机体对其吸收，提高其脂溶性和生物利用度，我们采

3、用亲核取代、酰胺化、酯化等方法将小檗碱与胆酸进行偶联，探索了不同胆酸取代基在小蘖碱不同取代位置对其生物活性的影响。研究发现，众多新生衍生物中，通过酯键将鹅脱氧胆酸连接到小檗碱的C．9位上合成出的2，3．Methenedioxy一9—0-(3，0L，7’cc—dihydroxy一5，B—cholan-24’．propy—lester)berberine(B4)，有较高的生物利用度，是小檗碱的4．7倍，同时具有有显著的抗菌活性，对许多肿瘤细胞都具有显著的增值抑制作用，包括肝癌细胞(SMMC一7721，BEL．7402)、胃癌细胞(SGC．79

4、01)、结肠癌(HCT-116)等，其中对肝癌SMMC一7721细胞的外抗肿瘤作用效果最显著，具有良好的开发前景。本论文主要借助细胞平台，运用多种实验手段，包括流式细胞术、激光共聚焦显微镜、琼脂糖凝胶电泳技术以及WeStemBlot蛋白印记等实验方法研究了B4诱导人肝癌SMMC．7721细胞凋亡的分子机制。主要研究结果如下：四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测B4对人肝癌SMMC．7721细胞的增殖抑制作用以及对人正常肝HL．7702细胞的毒性大小，实验结果表明B4对SMMC一7721细胞的增殖抑制效果明显强于小檗碱，并且呈现一定的时间和浓度上

5、的依赖性；B4对HL．7702正常肝细胞的毒副作用要远小于小檗碱，在O．4pM之州实验浓度下，B4对正常细胞的最大抑制率小于20％，毒性很小，因此将2斗M作为后续实验的最大给药浓度。观察B4作用SMMC．7721细胞后其形态学特征变化主要是通过激光共聚焦显微镜(LSCM)，结果表明2rtMB4孵育SMMC．7721细胞48h后，细胞形态发生显著的变化，细胞核缩皱并且边缘化，核仁破碎裂解，产生凋亡小体。通过流式细胞仪分析B4诱导SMMC．7721细胞发生凋亡和对细胞周期阻滞的影响。不同药物浓度处理SMMC．7721细胞48h后，随着给药浓度

6、的增加，处于G0／GI期和G2／M期细胞数不断减少，而S期细胞数不断增加，这表明B4能够诱导SMMC．7721细胞生长周期阻滞于s期。此外凋亡结果显示B4作用SMMC．7721细胞后，随着给药浓度的增加，细胞凋亡率也逐渐增加并且呈现一定的浓度依赖性，但是小檗碱作用后，SMMC．7721细胞的凋亡率却很低，表明B4对入肝癌SMMC．7721细胞的凋亡诱导作用要显著于小檗碱。流式细胞检测B4诱导SMMC．7721细胞内ROS水平、Ca2+浓度和线粒体膜电位(△吵m)的变化，发现随着给药浓度的增加，细胞内Ca2+、ROS的水平也逐渐增加，细胞△

7、ym却逐渐降低。为进一步研究ROS在B4诱导SMMC．7721细胞凋亡过程中起到的重要作用，我们在B4处理细胞之前，先用抗氧化剂N．乙酰半胱氨酸(NAO预处理万方数据摘要细胞1h，再用SMMC．7721细胞孵育48h。结果显示在一定的给药浓度范围内，NAC阻止了B4诱导的细胞内Ca2+、ROS水平的升高以及细胞△少m的降低，表明ROS能够调控B4诱导的SMMC一7721细胞凋亡。WesternBlot法主要分析了B4作用SMMC．7721细胞后常见的凋亡相关蛋白水平的变化，实验结果发现B4能诱导聚ADP一核糖聚合酶(PARP)裂解产物增加

8、以及caspase家族蛋白的活化，同时B4诱导细胞凋亡诱导因子(AIF)蛋白从线粒体易位到胞核，促使核内的DNA大量片段化，这表明B4可能通过激活caspase依赖性和非依赖性的细胞凋亡通路使